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研究背景和目的:多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma,MM）是成年人中第二常见的血液系统恶性肿瘤。包括来那度胺（Lenalidomide,Len）在内的免疫调节药物（IMiDs）是治疗多发性骨髓瘤的重要药物。免疫调节药物与E3泛素连接酶的底物受体CRBN相结合,促进CRBN招募新底物,如转录因子Ikaros（IKZF1）和Aiolos（IKZF3）,通过Cullin-4 RING E3（CRL4CRBN）泛素连接酶增强其泛素化降解,最终抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖。然而随着时间的推移,患者经常对免疫调节药物耐受,如何增加免疫调节药物的敏感性从而降低患者对这类药物的耐受成为目前亟待解决的一个问题。在免疫调节药物耐受机制中,CRBN-IKZF1/3分子轴是最重要的信号通路之一。因此尝试提高多发性骨髓瘤中CRBN的蛋白水平或许可以改善多发性骨髓瘤对免疫调节药物的耐受。自噬溶酶体通路（Autophagy Lysosome Pathway,ALP）是细胞中蛋白质降解的主要途径之一。已有研究证明CRBN可以通过蛋白酶体途径降解,但CRBN是否可以通过自噬溶酶体途径降解尚未被证实。BRCC36（也称BRCC3）是K63位多聚泛素链特异性去泛素化酶（Deubiquitinase,DUB）,它通过参与到BRISC和BRCA1-A复合体中发挥其去泛素化酶活性。BRCC36可以特异性切割K63位赖氨酸连接的多聚泛素链,使靶蛋白去泛素化,从而保护靶蛋白不受ALP途径降解。BRCC36参与到DNA损伤修复、免疫调节及炎症反应等生理过程,但是其在肿瘤中的作用还未知。且BRCC36是否可以影响CRBN的自噬溶酶体途径降解从而影响免疫调节药物敏感性尚不清楚。在本论文中,本课题组首先发现了CRBN新的相互作用蛋白BRCC36,随后证实了BRCC36可以调控CRBN蛋白水平,接着进一步深入研究了 BRCC36和CRBN在多发性骨髓瘤细胞对来那度胺敏感性中的功能及其分子机制。研究方法:首先,为了寻找新的CRBN相互作用蛋白,本课题组使用邻近生物素标记TurboID和蛋白组学方法发现了 CRBN相互作用蛋白BRCC36,通过免疫共沉淀实验以及免疫印迹实验来验证BRCC36和CRBN两者的相互作用。同时在HEK293细胞系中过表达BRCC36和CRBN,利用免疫荧光观察二者的共定位。接着通过在HEK293T细胞和多发性骨髓瘤细胞系中分别过表达和敲低BRCC36探究BRCC36对CRBN的调控关系。对四种多发性骨髓瘤细胞系的细胞裂解液用免疫印迹实验探究BRCC36与CRBN蛋白水平的相关性。并在HEK293T细胞中敲低SHMT2、RAP80来探究SHMT2、RAP80对CRBN的调控关系。本课题组分别使用DMSO和SHIN1处理HEK293T细胞和多发性骨髓瘤细胞系,在细胞裂解液中用免疫印迹实验证实SHIN1对BRCC36和CRBN蛋白水平的影响。为了获得BRCC36稳定敲低的HEK293T、HeLa和多发性骨髓瘤细胞系,利用敲低BRCC36的shRNA慢病毒对其进行侵染。在BRCC36稳定敲低的HEK293T细胞系中研究BRCC36对CRBN泛素化修饰水平的影响。利用自噬溶酶体抑制剂BafA1探究BRCC36在CRBN降解中的作用。最后通过利用免疫印迹实验和CCK-8细胞增殖实验在多发性骨髓瘤细胞株中探究BRCC36对CRBN的调控以及在多发性骨髓瘤细胞对免疫调节药物来那度胺敏感性中的作用。研究结果:研究发现BRCC36与CRBN在细胞质中存在相互作用。使用FLAG affinity gel和CRBN抗体进行免疫共沉淀实验进一步证实了无论是外源性还是内源性的BRCC36与CRBN均存在相互作用。在多发性骨髓瘤细胞系中发现BRCC36和CRBN的蛋白水平呈正相关。然后利用siRNA在HEK293T、HeLa、RPMI-8226及LP1细胞中敲低BRCC36后发现CRBN的蛋白水平明显下调,证实了 BRCC36对CRBN蛋白的调控。用自噬溶酶体抑制剂Baf A1处理同时过表达BRCC36与CRBN后的HEK293T细胞,发现Baf A1逆转了 BRCC36对CRBN的保护作用,并在CRBN的泛素化实验中发现敲低BRCC36显著增加了 CRBN的K63位多聚泛素化。免疫共沉淀和免疫印迹实验证明了 BRCC36调控CRBN是依赖其去泛素化酶活性,进而通过抑制溶酶体途径降解从而阻止CRBN下调。在此基础上用SHMT2抑制剂SHIN1处理HEK293T细胞后,BRCC36蛋白水平明显上调,同时CRBN蛋白水平也随之上调。这一现象随后也在多发性骨髓瘤细胞中得到证实。并且通过用SHIN1处理BRCC36稳定敲低的HeLa细胞株,发现敲低BRCC36阻断了 SHIN1对CRBN的上调作用,证实了 SHIN1上调CRBN依赖于BRCC36。在功能上,用CCK-8细胞增殖实验证明了 Len和SHIN1联合用药后,多发性骨髓瘤细胞增殖水平明显低于单独各自用药,同时在多发性骨髓瘤细胞系中用Len和SHIN1联合处理后IKZF1/3的蛋白水平明显比单独各自用药减少。研究结论:BRCC36通过BRISC复合体来保护CRBN不受K63位多聚泛素化依赖的自噬溶酶体途径降解,这一调控依赖于其去泛素化酶活性。SHIN1可以通过上调BRCC36进而稳定CRBN,且以剂量依赖的方式调控CRBN蛋白水平,该调控方式会增加多发性骨髓瘤细胞对免疫调节药物来那度胺的敏感性。该工作将为克服多发性骨髓瘤细胞免疫调节药物的耐药性提供一个新的思路。