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目的:观察mTOR激酶抑制剂WYE-687体内外抗RCC细胞的作用,旨在为RCC的分子靶向治疗进行新的探索。方法:(1)MTT法、细胞集落形成试验检测不同浓度的WYE-687处理不同作用时间后对RCC细胞存活的影响。取各组对数生长期细胞,药物或对照处理后,活细胞用MTT染色。酶标仪在490 nm处测定吸光度(OD)值。计算细胞存活率。取各组对数生长期细胞,药物或对照处理后,观察剩余的直径大于40μm集落的数目,与对照组比较,计算细胞增殖率。(2)Caspase-3试剂盒方法检测WYE-687对RCC细胞凋亡的作用。样本加入Caspase-3底物后在37度培养箱中孵育,用分光光度计在λ=355 nm测定其吸光值。通过计算荧光单位/μg蛋白来反应Caspase-3/-9活性。Annexin V-PI流式细胞仪法检测WYE-687对RCC细胞凋亡的作用。将样本消化处理,离心沉淀,加入Annexin V孵育后流式细胞仪上样,根据检测结果,计算细胞凋亡率。Western Blotting法检测WYE-687处理后的促凋亡蛋白cleaved-Caspase-3的表达变化;(3)[H3]胸腺嘧啶掺入测定法和BrdU ELISA测定法检测不同浓度的WYE-687处理不同作用时间后对RCC细胞增殖的影响;在[H3]胸腺嘧啶(1μCi/mL,Sigma)添加到WYE-687处理的细胞中,通过液体闪烁光谱法计数等分试样,将治疗组的[H3]胸腺嘧啶值标准化为对照值。将细胞与BrdU孵育并固定,通过ELISA方法(405 nm)测定BrdU掺入。(4)运用Western blotting的方法,观察WYE-687处理RCC细胞后,mTOR信号通路的变化;(5)建立裸鼠荷瘤模型。786-O RCC细胞注射到左肋腹部皮下,观察口服WYE-687在体抗RCC细胞活性。每5天测量体重和肿瘤体积。异种移植肿瘤的组织切片用IHC染色。结果:(1)WYE-687对培养的人RCC细胞系(786-O和A498)和原代人RCC细胞具有显著的细胞毒性作用;而相同的WYE-687处理HK-2正常肾小管上皮细胞并无显著的细胞毒性作用;(2)WYE-687诱导人RCC细胞的凋亡。在10-1000nM的WYE-687处理后,Caspase-3活性和Annexin V染色的细胞数都显著增加,剂量依赖性地诱导786-O细胞凋亡。在786-O细胞中通过WYE-687处理后诱导Caspase-3表达降低。并且,WYE-687(100nM)诱导的786-O细胞凋亡和Annexin V染色增加,能被Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-cho或广谱Caspase抑制剂Ac-VAD-cho所阻断。(3)WYE-687抑制人RCC细胞增殖。在WYE-687(10-1000nM)处理后,BrdU ELISA OD和[H~3]胸腺嘧啶掺入均显著降低,剂量依赖性地抑制786-O细胞增殖。WYE-687在抑制786-O细胞增殖作用比相同浓度的雷帕霉素和依维莫司更强。同样WYE-687处理后,HK-2肾小管上皮细胞的增殖并未受到影响(4)WYE-687阻断RCC细胞中mTORC1和mTORC2的活化。WYE-687(100nM)处理786-O RCC细胞2小时后,几乎完全阻断Akt(Ser-473),S6K1(Thr-389)和S6的磷酸化(“p-”)(Ser-235/236)。原代人RCC细胞中也有相同的结果,WYE-687(100nM)处理2小时后同时阻断mTORC1(p-S6K1,p-S6)和mTORC2(p-Akt Ser473)。(5)WYE-687下调RCC细胞中HIF-1α和HIF-2α的表达;(6)在裸鼠荷瘤模型中,WYE-687口服给药显著抑制786-O移植瘤的在体生长。肿瘤生长速度明显降低。WYE-687处理的裸鼠的体重与对照组比较,差异无统计学意义。(7)WYE-687处理的786-O移植瘤组织中,mTORC1/2和HIF-1α/2α表达也受到显著抑制。结论:WYE-687同时阻断mTORC1和mTORC2的活化,并在体外和体内抑制RCC细胞的生长;