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扇贝裙边指扇贝的外套膜,是扇贝柱加工的主要副产物。为了提升扇贝裙边的利用价值,本研究利用两步酶解法水解海湾扇贝裙边制备ACE抑制肽。具体研究内容如下: QSAR定量构效关系研究结果认为当羧端为脯氨酸时,能够提升多肽的ACE抑制活性。我们选取了已报道的IC50值不大于10μM的食品源的ACE抑制肽共121个,对其羧端结构进行分析,发现1/3的肽羧端都是脯氨酸,验证了QSAR定量构效关系所揭示规律。按照该结论,选取α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A/B对扇贝裙边进行两步酶解,以获得羧端为脯氨酸的多肽。 对海湾扇贝裙边进行预处理,制成扇贝裙边粉。分析其蛋白质含量和氨基酸组成,结果表明扇贝裙边富含蛋白质(52.5±0.8%),其中脯氨酸含量占总蛋白含量的5.2%。分别在α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A/B的最优酶解条件下,以水解度为指标,确定最优酶解时间,结果表明α-胰凝乳蛋白酶的最优水解时间为5h,羧肽酶A/B的最优水解时间为8h。 然后,以ACE抑制活性为筛选指标,对海湾扇贝酶解液进行分离、纯化。第一步用500 Da和1000 Da的透析袋进行透析,得到<500 Da与500~1000 Da两个组分,其IC50值分别为1376.00μg/mL和893.00μg/mL。第二步采用离子交换层析对上述两组分进一步分离,<500 Da组分被分离为F1,F2两个组分,500~1000 Da组分被分离为F3,F4,F5三个组分,其中F5具有最高ACE抑制活性(IC50=368.00μg/mL)。第三步采用凝胶层析色谱对F5进一步分离,得到F5-1,F5-2,F5-3三个组分,其中F5-2组分显示最高ACE抑制活性,IC50值为163.00μg/mL。第四步采用反相-高效液相色谱对F5-2组分进一步分离,RP-HPLC结果显示,F5-2组分可以分为9个峰(a-i,5个峰具有ACE抑制活性),其中F5-2g显示最低的IC50值,为19.20μg/mL,具有很强ACE抑制活性,是目标分离组分。最后通过氨基酸成分分析、质谱分析和氮端序列分析,共同对所分离的F5-2g组分进行结构鉴定。氨基酸成分分析结果显示,F5-2g组分约含有两个Val,一个Leu,一个Ile,一个Pro。质谱分析结果显示,F5-2g组分主要成分的质荷比为540.3759,表明其氨基酸组成与成分分析结果一致。氮端序列分析结果进一步证明F5-2g组分主要成分氨基酸序列为Val-Leu-Ile-Val-Pro,羧端是脯氨酸,与理论预期相符。对该ACE抑制肽进行人工合成,检测ACE抑制活性,其IC50值为10.60μg/mL,低于F5-2g组分的19.20μg/mL,表明其通过合成和纯化后,具有更高ACE抑制活性;且通过胃肠道消化模拟,证明其不被消化酶水解。根据米氏方程对该肽进行抑制动力学研究,通过Lineweaver-Burk作图法,证明属于竞争性抑制,并测得其抑制常数Ki为6.12μg/mL。 综上所述,用α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A/B复合酶解海湾扇贝裙边,通过透析、离子交换层析、凝胶层析、高效液相色谱等分离纯化技术,制备得到羧端为脯氨酸的ACE抑制肽,其氨基酸序列为Val-Leu-Ile-Val-Pro,IC50值是10.60μg/mL,属于竞争性抑制,抑制常数Ki等于6.12 ug/mL。