环境内分泌干扰物(EDCs)暴露可能引起机体免疫功能损伤。国内外相关研究表明双酚A(BPA)和邻苯二甲酯类(PAE)等EDCs可能引起机体免疫损伤过程中活化蛋白(AP-1)、转因子(NF-AT)、核转录因子(NF-KB)等转录因子的变化。同时,又有一些专家认为在这一过程中雌激素可能扮演着重要角色。壬基酚(NP)作为EDCs的典型代表,具有拟雌激素活性,但是却缺少这方面的研究。关于NP引起机体免疫功能损伤过程中,转录因子和雌激素的变化情况却鲜少有相关报道。本研究通过灌胃方式模拟人群接触NP的主要途径,建立动物模型,结合生物信息学高通量测序技术,探究NP暴露引起机体免疫损伤过程中,转录因子、雌激素受体、相关免疫因子的变化情况,探究其之间的关系。第一部分亚慢性壬基酚暴露对大鼠免疫功能、转录因子和雌激素受体的影响目的:探讨雄性大鼠亚慢性暴露NP是否诱导大鼠的免疫损伤,炎症因子、免疫因子和雌激素受体的变化。方法:SD大鼠随机分为5组,空白对照组(C组)每日给予玉米油5ml/kg,NP染毒剂量组:低(L)、中(M)、高(H)每日给予NP(0.4、4、40mg/kg)灌胃染毒,每组12只。连续灌胃180天,其中90天和180天分别剖杀一次。大鼠腹腔注射20%氨基甲酸乙酯(0.5 ml/100g)进行麻醉、剖杀和取材。观察大鼠的体重和脾脏、胸腺脏器系数变化;吉姆萨染色后镜下数淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞(五种主要的炎症细胞)数量,对其进行定量计数;血液生化分析仪检测外周血血液参数变化;酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清中IL-4、ER-α、ER-β水平;透射电镜观察胸腺、脾脏组织的超微结构变化。病理切片(苏木精-伊红染色)观察胸腺(皮质区,髓质区面积)、脾脏组织(脾小结个数、白髓相对面积、淋巴小结面积)、回肠的Peyers淋巴结(淋巴滤泡长短经、生发中心长短经)的免疫损伤表现,采用Image-pro plus 6.0软件进行定量分析;紫外分光器法检测血清免疫球蛋白Ig E、Ig G、Ig M水平;流式法检测外周血淋巴细胞亚群(T淋巴细胞群,B淋巴细胞群,NK细胞群)变化;免疫组化法(IHC)检测脾脏组织中雌激素受体ER-α、ER-β水平变化;免疫荧光法(IF)检测脾脏组织活化蛋白(AP-1)、核因子(NF-AT)、核转录因子(NF-kB)蛋白的变化。结果:0.4、4、40mg/kg NP组与Control组比较:1)随着时间和染毒暴露剂量的变化,体重逐渐增加,暴露前160天各组间比较无统计学差异(P>0.05),暴露160天开始出现统计学差异(P<0.05);2)与实验对照组比较,NP染毒组大鼠的胸腺、脾脏重量下降明显,各组大鼠胸腺、脾脏脏器系数间比较,有统计学意义(P<0.05)。3)吉姆萨染色镜下计数结果显示中性粒细胞数差异有统计学意义(P<0.05),白细胞总数、淋巴细胞、单核细胞、红细胞差异无统计学意义(p>0.05)。4)外周血常规检测结果显示,与对照组比较,各NP染毒组大鼠外周血白细胞数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞比率显著升高,淋巴细胞比率明显降低(P<0.05);相对于空白对照组,外周血中红细胞计数、单核细胞数计数、嗜酸性粒细胞比率变化无显著差异(p>0.05)。5)ELISA检测血清中IL-4、ER-α、ER-β水平,相对于空白组,各染毒组表达逐渐增多(P<0.05)。4)HE染色结果提示,随着染毒剂量加大,胸腺皮质与髓质面积逐渐减小(P<0.05);脾脏的小结数和脾小结面积、白髓相对面积与空白组比较有统计学差异(P<0.05),Peyers淋巴结中淋巴滤泡长短经、生发中心长短经逐渐减小,与空白组比较有统计学差异(P<0.05)。5)透射电镜结果显示,随着染毒剂量的加大,脾脏、胸腺淋巴细胞内有少数凋亡小体形成,部分淋巴细胞内出现了线粒体肿胀肥大,局部空泡化,嵴紊乱不齐,内质网扩张的现象。6)随着染毒剂量的增加,血清中Ig G、Ig M的含量相对空白对照组有下降的趋势(P<0.05),血清中Ig E的含量相对空白对照组有增加的趋势(P<0.05)。7)免疫组化结果显示相对于空白对照组雌激素受体ER-α、ER-β蛋白相对表达显著增加(P<0.05)。8)免疫荧光结果显示脾脏组织中活化蛋白AP-1、转录因子NF-AT蛋白表达相对增加,核转录因子NF-kB蛋白表达相对减少,与空白组比较有显著差异(P<0.05)。结论:1.4、40(mg/kg/day)NP亚慢性暴露180天可致大鼠免疫功能紊乱,产生免疫功能损伤和炎症效应。2.4、40(mg/kg/day)NP亚慢性暴露180天可致脾脏组织中雌激素受体ER-α、ER-β蛋白相对表达增加。3.4、40(mg/kg/day)NP亚慢性暴露180天导致大鼠IL-4分泌水平显著升高,同时调节IL-4合成分泌的活化蛋白AP-1、转录因子NF-AT的活性增强,核转录因子NF-kB蛋白相对表达减少。第二部分利用生物信息法对大鼠的雌激素受体、差异基因、免疫相关因子之间关系进行验证和研究目的:应用m RNA-seq高通量筛选的生物信息学技术对NP暴露组和对照组脾脏组织的差异基因进行筛选,观察相关免疫因子的表达变化,并且予以验证。探讨NP亚慢性暴露对大鼠的雌激素表达、转录因子变化和免疫损伤、炎症的关联影响。方法:运用高通量筛选技术对(Control组3例和NP 40mg/kg灌胃高剂量组3例)共6例独立样本进行m RNA表达谱的筛选,通过生物信息学分析,获取m RNA的差异表达基因。进一步利用GO及Pathway分析差异表达免疫相关因子。初步整合分析m RNA相互调控网路,探究在大鼠的雌激素依赖性的免疫炎症的中可能存在的分子调节机制。实时荧光定量PCR法检测各组中的ER-α、ER-β、NF-KB、IL4、AP-1、NF-AT和差异免疫因子的m RNA表达量;蛋白印迹法检测相对应的ER-α、ER-β、NF-KB、IL4、AP-1、NF-AT和差异免疫因子的相对蛋白表达量。采过高效液相色谱法(HPLC)对大鼠暴露180天脾脏组织中的NP含量进行检测;并将上述变化指标与暴露180天脾脏组织中的NP含量之间进行相关性分析。同时ELISA法检测血清中IL-4、ER-α、ER-β水平也与180天脾脏组织中的NP含量之间进行相关性分析。结果:通过高通量筛选技术,筛选m RNA在空白对照组与NP 40mg/kg灌胃高剂量组中差异表达,获得810个差异表达基因,其中上调的363个,下调的447个。与免疫炎症功能相关的差异表达基因中下调的是:TLR4,TLR3,TLR11,CD80,Gata3,IL12,TL9R,CD21,MKK3/6,TGF-α,IAP,XIAP。上调的是:IL1R,TNF-a,IL10,TLR2,INOS,IL1β,CD18,CXCL4。实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测ER-α、ER-β、NF-KB、IL4、AP-1、NF-AT和相关差异免疫因子的RNA表达显示,NP(4、40mg/kg)灌胃组m RNA表达变化与对照组比较有显著性差异(p<0.05),ER-α、ER-β、IL4、AP-1、NF-ATm RNA相对表达逐渐增加(p<0.05),TLR4、Gata3、NF-KBm RNA相对表达逐渐减少,其他免疫因子变化趋势与高通量筛选结果保持一致(p<0.05)。随着NP暴露剂量和时间的增加,大鼠脾脏组织中ER-α、ER-β、IL4、AP-1、NF-AT蛋白相对表达逐渐增加(p<0.05);TLR4、Gata3、NF-KB、IL12蛋白相对表达有减少的趋势(p<0.05)。大鼠脾脏组织中NP含量与脾脏组织中AP-1、NF-AT、NF-k B、ER-α、ER-β蛋白表达量呈现相关关系(P<0.05),与ELISA法检测血清中IL-4、ER-α、ER-β水平有明显相关关系(P<0.05)。结论:高通量筛选结果验证了第一部分动物实验的结果和结论。NP能导致大鼠雌激素依赖性的免疫损伤和免疫炎症信号传导、免疫应答、炎症反应因子等相关基因的差异表达,以上改变有可能干扰免疫系统的功能和雌激素的表达。NP可能通过影响ER-雌激素受体,使其激活AP-1、NF-AT、NF-k B等转录因子变化,从而促进IL-4表达。进而影响整个免疫炎症系统的表达。