论文部分内容阅读
自1990年Handyside等人应用植入前遗传学诊断技术(Preimplantation genetic diagnosis,PGD)筛选胚胎进行移植后,PGD在全世界范围内广泛运用。PGD过程涉及一系列非生理性操作,这些非自然或侵入性的操作均作用于配子发生/成熟、胚胎早期发育等敏感时期。然而,其对子代的生长发育是否具有潜在的不良影响,这在PGD广泛用于临床之前并没有经过全面评估。随着“胚胎源性疾病”学说的确立,胚胎期的影响在个体出生后疾病的发生发展中的作用得到公认,因此,PGD子代的健康状况亟待评估。本研究通过构建PGD小鼠模型(受精卵体外培养至4细胞期后随机移除一个卵裂球后移植入假孕母鼠体内出生的小鼠),以IVEM小鼠(受精卵体外培养至4细胞期后不移除卵裂球,直接移植入假孕母鼠体内出生的小鼠)和Normal组小鼠(正常生育的小鼠)为对照的方法,对PGD子代小鼠的糖代谢状况进行了评估,试图揭示PGD是否有诱导小鼠糖尿病(潜在的胚胎源性疾病)发生的潜在风险及作用机制。我们首先对三组小鼠的糖代谢血液指标进行检测和比较,包括空腹血糖、餐后血糖,以及血清胰岛素和胰高血糖素浓度,以期从血糖和激素水平来了解小鼠的血糖调节能力是否存在异常。血糖检测结果显示:PGD组和IVEM组小鼠空腹血糖较Normal组高,其中PGD组和Normal组比较存在统计学差异,但是IVEM与Normal比较未见统计学差异;腹腔注射葡萄糖后,三组小鼠的血糖水平均迅速上升,在15min时均达到峰值,随后血糖逐渐下降至空腹水平,注射葡萄糖后三组小鼠各时间点的血糖值比较未见明显差异。激素测定结果显示:①三组小鼠血清胰高血糖素浓度没有显著差异。②三组小鼠空腹胰岛素水平无显著差异;注射葡萄糖后(15min、60min、120min),PGD和IVEM组胰岛素水平均高于Normal组,其中PGD组和Normal组比较有统计学差异,但是IVEM组和Normal组之间无统计学差异。血液指标检测结果表明虽然PGD组空腹血糖较Normal组高,但是高糖刺激下的胰岛素分泌仍然能够将血糖调节回空腹水平。为了进一步探究空腹血糖升高的原因,我们对糖代谢相关器官(肝脏、骨骼肌、胰腺)的结构和功能进行了研究。形态学比较发现,三组小鼠糖代谢相关器官的组织结构间未见明显差异。功能上,我们主要对肝脏和骨骼肌糖代谢情况进行了比较分析。生理状态下,肝细胞和骨骼肌细胞可主动摄取血液中的葡萄糖,将其转化成糖原储备于肝脏和骨骼肌中,因此我们可以通过检测肝脏和骨骼肌的糖原含量来了解机体糖原贮备情况。检测结果显示:①三组小鼠肌糖原含量没有显著差异。②PGD和IVEM组小鼠的肝糖原含量显著低于Normal组。结果提示PGD和IVEM组小鼠肝脏糖原储备能力下降。随后我们对肝脏中糖代谢各途径的关键酶从表达量和活性两方面进行了检测。结果显示:①这些关键酶的表达量在三组小鼠之间无统计学差异②PGD和IVEM组小鼠肝脏的糖原合酶(GS)、柠檬酸合酶(CS)以及α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)活性较Normal组均降低,PGD组和Normal组比较有统计学差异,而IVEM组和Normal组之间无统计学差;其中PGD组GS和α-KGDH活性较IVEM组呈下降趋势,但无统计学差异。酶活性结果提示PGD子代小鼠肝脏糖原合成能力和葡萄糖氧化分解能力下降,可能是引起PGD组血糖升高的原因。虽然目前关于胚胎源性疾病的发病机制还没有得到明确的阐述,但是有越来越多的研究证实表观遗传学修饰对生长发育起着重要的作用。印记基因的甲基化修饰是目前研究的热点,因此我们也选择了较为经典的印记基因Igf2、H19、Mest,分别从甲基化率和表达两方面进行研究。结果发现三组小鼠H19DMR、Igf2 DMR2、Mest DMR的甲基化率没有显著差异;但是PGD和IVEM组H19的表达量显著低于Normal组,PGD组较IVEM组呈下降趋势,但无统计学差异。结果提示PGD所涉及的操作可能影响子代小鼠肝脏H19表达。综合糖代谢评估和机制探究的结果,我们初步推断PGD所涉及的一系列操作可能通过影响小鼠肝脏H19表达,从而引起肝脏糖代谢紊乱,甚至可能有潜在的引发糖尿病的风险。IVEM组GS和α-KGDH活性较Normal组呈现下降的趋势,但是不及PGD组下降明显,提示PGD特有的卵裂球活检虽然没有引起肝脏糖代谢的显著异常,但是和PGD所涉及的其他操作一起可能会产生累加效应,从而共同影响子代的生长发育以及糖代谢水平。因此要判断PGD特有的卵裂球活检是否会影响PGD子代糖代谢,以及其可能的机制我们还需进一步研究。