背景如何减轻移植肝缺血/再灌注（I/R）损伤是肝移植研究领域的重难点。I/R过程造成移植肝细胞的线粒体损伤程度超过其自噬清除能力,进而导致细胞死亡（包括坏死和凋亡）。维持或重建线粒体功能障碍与细胞自噬活性间的平衡可能成为缓解移植肝I/R损伤的新策略。临床研究证实,与常规初始门静脉灌注（IPR）比较,经下腔静脉（IVC）逆灌注（RTR）技术可缓解移植肝I/R损伤,对移植肝功能具有保护作用,但相关机制尚未阐明。目的本研究将改良大鼠原位肝移植模型,以经典IPR技术作为对照,观察RTR技术对移植肝细胞毒性、自噬活性、活性氧（ROS）形成、Ca2+超载、线粒体损伤程度的作用,并通过蛋白质组学技术以探究其中涉及的分子网络。以期阐明RTR方式缓解移植肝I/R损伤的潜在机制,为在临床肝移植中推广应用RTR技术提供重要证据和理论基础,同时为因其他情况（如肝切除手术、失血性休克）而导致的肝脏I/R损伤贡献新的治疗思路。方法（一）通过改良“双袖套”技术,建立一种可以灵活模拟IPR或RTR两种灌注方式的大鼠原位肝移植模型。其中,IPR方式为首先重建并开放门静脉（PV）,待PV正向灌注5 min后再恢复IVC血流;而RTR技术则先重建并开放IVC,待腔静脉逆向灌注5 min后再恢复PV血流。记录术中移植肝缺血时间和受体大鼠肝移植术后7天生存率,以判断模型的有效性和稳定性。（二）与常规的IPR方式比较,观察RTR技术对肝移植术后7天受体大鼠的丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性、组织病理学改变（以肝细胞坏死、炎症细胞浸润和微循环障碍作为主要判断标准）、原位细胞凋亡情况（通过TUNEL法检测）和活化Caspase-3表达水平（通过免疫组化技术检测）的影响,从组织和整体动物层面评估RTR技术对移植肝I/R损伤的作用。（三）以常规的IPR方式作为对照,使用免疫印迹的方法并联合氯喹（CQ）预处理检测RTR技术对移植肝灌注后1、2、6 h的微管相关蛋白质1轻链3（LC3）转换水平和p62/SQSTM1蛋白表达情况的影响,以说明RTR技术对移植肝自噬活性的作用。然后,通过透射电子显微镜（TEM）检查亚细胞结构,从形态学角度辅助判断灌注方式对移植肝自噬功能的影响,同时观察线粒体损伤程度的差异。（四）分别使用Calcein-AM/Calcein-AM+Co Cl2、JC-1、DCFH-DA和Rhod-2/AM作为荧光探针,通过流式细胞仪实时检测并对比灌注方式对移植肝线粒体通透性孔道（MPTP）开放情况、线粒体膜电位（MMP）水平、细胞内ROS浓度和Ca2+含量的影响;同时使用血气分析仪检测不同灌注方式的初始灌注血流氧饱和情况。综合说明RTR技术的腔静脉血流灌注对细胞线粒体损伤的影响和可能机制。（五）使用基于串联质谱标签（TMT）的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学技术检测采用不同灌注方式的移植肝差异性表达蛋白,然后通过亚细胞定位、基因本体（GO）功能、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路、蛋白相互作用网络（PPI）等生物信息分析手段筛选出目标蛋白,最后采用平行反应监测（PRM）方法对选中的目标蛋白进行验证,以期全面阐明RTR技术对移植肝功能保护作用的可能机制。结果（一）各组大鼠的术后7天生存率均为100%,而且与临床结果一致的是RTR技术可缩短移植肝的温缺血时间（WIT）。说明本研究建立的改良大鼠原位肝移植模型能够稳定且有效地模拟IPR或RTR方式。（二）与常规的IPR方式比较,RTR技术可降低受体大鼠肝移植术后7天ALT活性、减轻组织病理学损伤和原位细胞凋亡程度,说明RTR技术可一定程度地减轻移植肝I/R损伤。（三）以常规的IPR方式作为对照,采用RTR技术后移植肝的LC3转换水平下降幅度减小且p62蛋白表达峰值出现推后,说明RTR技术可有效缓解I/R损伤所致的自噬活性抑制。同时,TEM检查结果亦表明,RTR组移植肝细胞线粒体损伤变性较轻。（四）综合分析流式细胞检查和血气分析结果发现,RTR技术通过含氧量较低的腔静脉血流灌注移植肝,减缓了灌注后的氧供恢复,可有效减少ROS产生和Ca2+超载,进而减少了MPTP开放且更好地维持了MMP水平。（五）经基于TMT的LC-MS/MS蛋白质组学检测和生物信息学分析筛选出3种差异性表达的目标蛋白,分别为纤维蛋白原β链（Fgb）、雌激素硫转移酶（EST）和溶酶体相关膜蛋白1（Lamp1）。PRM检测证实了RTR技术可抑制Fgb和EST的表达、缓解Lamp1降解,推测这些因素也参与了RTR技术对移植肝功能的保护机制,但仍需进一步研究证实。结论RTR技术通过低氧饱和度的腔静脉血流灌注移植肝,减缓了移植肝的氧供恢复速度,从而减少了ROS产生和Ca2+超载,缓解了I/R所致的线粒体损伤和自噬活性抑制,有利于维持线粒体功能障碍和自噬清除能力之间的动态平衡。因此,RTR技术可减轻I/R损伤、保护移植肝功能。同时,抑制Fgb和EST的表达、缓解Lamp1降解也可能参与RTR技术对移植肝功能的保护作用,但仍需进一步研究证实。