【摘 要】
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碱性蛋白酶（Alkaline protease,ALK）是指在p H值偏碱性范围内能够水解蛋白质肽键的一类酶,其在洗涤剂、医药、皮革和食品等行业都得到了广泛应用。其中,克劳氏芽孢杆菌来源的ALK主要应用于洗涤剂行业,但其在低温下的活力仍然有限,从而限制了洗涤剂在低温条件下的作用效果。因此,本文旨在通过对ALK进行分子改造,筛选低温下高活力的ALK突变体,以期满足目前洗涤行业对低温ALK需求的现状。
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碱性蛋白酶（Alkaline protease,ALK）是指在p H值偏碱性范围内能够水解蛋白质肽键的一类酶,其在洗涤剂、医药、皮革和食品等行业都得到了广泛应用。其中,克劳氏芽孢杆菌来源的ALK主要应用于洗涤剂行业,但其在低温下的活力仍然有限,从而限制了洗涤剂在低温条件下的作用效果。因此,本文旨在通过对ALK进行分子改造,筛选低温下高活力的ALK突变体,以期满足目前洗涤行业对低温ALK需求的现状。以Bacillus clausii TCCC 11004的基因组为模板,克隆ALK基因,构建重组质粒pLY-3-alk,并将其化转到枯草芽孢杆菌WB600中进行表达。通过对ALK同源建模和其与底物AAPF的对接结果分析,选出了与底物作用的关键热点区域Gly95-Val102,Pro127-Ser123。对ALK的Gly95、Ala96、Ser97、Gly98、Ser99、Gly100、Ser101、Val102、Pro127、Ser126、Gly125、Leu124、Ser123共13个位点进行迭代饱和突变,10℃下对ALK的突变体进行筛选,最终筛选获得了6个酶活力提高的突变体MT1（G95P）、MT2（G95P/A96D）、MT3（G95P/A96D/S99W）、MT4（G95P/A96D/S99W/S101T）、MT5（G95P/A96D/S99W/S101T/P127S）、MT6（G95P/A96D/S99W/S101T/S126T/P127S）,其中MT6突变体的酶活力最高。在10℃下对六个突变体的酶促反应动力学参数进行测定,MT1的Kcat/Km为野生型（WT）的2.2倍,MT2的Kcat/Km为WT的3.0倍,MT3的Kcat/Km为WT的4.4倍,MT4的Kcat/Km为WT的5.4倍,MT5的Kcat/Km为WT的10.4倍,MT6的Kcat/Km为野生型（WT）的18.3倍。利用分子动力学（MD）模拟技术分析突变体MT6在低温条件下活性提升的分子机制,结果显示,与WT相比,MT6的底物结合口袋空腔变大,使得AAPF能够更加顺利的进入底物结合口袋,导致AAPF与活性氨基酸位点之间距离的缩短,从而使AAPF与其活性位点的相互作用增强,提高了低温条件下MT6对AAPF的催化活性。
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