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目的:探究砷暴露对巨噬细胞ABCA1启动子区DNA甲基化改变和基因表达的影响,同时明确砷暴露对巨噬细胞胆固醇流出及细胞凋亡的作用。方法:分别以0μM、4μM、8μM、12μM次砷酸钠暴露THP-1巨噬细胞48 h,抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理1 h后与12μM次砷酸钠共暴露48 h,CCK-8法检测细胞活性改变,流式细胞术DCFH-DA染色法检测巨噬细胞内氧化应激情况,激光共聚焦法检测细胞内NADPH氧化酶胞质组分p47phox在细胞内的定位,焦磷酸测序检测ABCA1基因启动子区DNA甲基化情况,实时定量PCR检测ABCA1基因在巨噬细胞内的表达情况,western检测ABCA1蛋白在巨噬细胞内的表达情况。巨噬细胞加入50μg/m L ox-LDL诱导48 h以产生泡沫化巨噬细胞,然后油红染色法检测泡沫细胞内脂质富集情况,总胆固醇和游离胆固醇检测试剂盒检测胆固醇富集和流出情况。最后hoechst染色法、流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测巨噬细胞的凋亡情况。结果:THP-1巨噬细胞生存率与砷暴露浓度呈负相关关系,12μM次砷酸钠暴露48 h之后,巨噬细胞生存率下降为66.9%,所以我们选择0、4、8、12μM次砷酸钠作为后续实验的砷暴露浓度。加入NAC干预之后,巨噬细胞生存率相对于12μM次砷酸钠组有显著回复。巨噬细胞内ROS产生与砷暴露浓度呈正相关关系,12μM次砷酸钠组达到最高,比对照增加了0.78倍。加入NAC干预之后,巨噬细胞内ROS的产生相对于12μM次砷酸钠组降低显著,仅比对照增加了0.16倍。随着次砷酸钠浓度的增加,p47phox转移至胞膜巨噬细胞数量占总细胞数的百分比显著增加,加入NAC干预之后,巨噬细胞内p47phox转移至胞膜细胞百分比相对于12μM次砷酸钠组有明显下降。对ABCA1基因启动子区A位点8个Cp Gs的焦磷酸测序结果显示,砷暴露能够导致巨噬细胞内ABCA1基因启动子区域多个Cp G位点的甲基化程度显著上升。4μM次砷酸钠组中,仅Cp G3甲基化上调17.9%;8μM次砷酸钠组中,Cp G1、Cp G2、Cp G3、Cp G4、Cp G6甲基化分别上调48%、9.7%、7.6%、18.3%、15.0%;12μM次砷酸钠组中,Cp G1、Cp G 2、Cp G 3、Cp G6分别上调20.5%、9.7%、28.1%、16.3%;Cp G7和8变化不显著。加入NAC干预之后,巨噬细胞内ABCA1基因启动子区域部分Cp G位点甲基化程度显著回复,其中Cp G1、4、6甲基化程度分别比12μM次砷酸钠组降低了44.9%、10.0%、9.89%;Cp G2、3、5、7甲基化程度变化不显著。巨噬细胞内ABCA1基因和蛋白表达与砷暴露浓度呈负相关关系,12μM时基因和蛋白的表达分别为对照的30.2%和22.5%,加入NAC干预之后,巨噬细胞内ABCA1基因和蛋白表达相对于12μM次砷酸钠组有显著回复。巨噬细胞内脂质富集与砷暴露浓度呈正相关关系,细胞内总胆固醇含量与砷暴露浓度呈正相关关系,胆固醇流出率与砷暴露浓度呈负相关关系。随着次砷酸钠浓度的增加,巨噬细胞内脂质富集显著,总胆固醇含量显著增加,胆固醇流出率显著下降。加入NAC干预之后,巨噬细胞内脂质富集相对于12μM次砷酸钠组下降显著,总胆固醇含量显著降低,胆固醇流出率显著回升。Hoechst染色和流式细胞术检测巨噬细胞凋亡结果表明,产生皱缩细胞核的细胞百分比和细胞凋亡率与砷暴露浓度呈正相关关系,在12μM次砷酸钠组达到最高。加入3000μM NAC干预之后,产生皱缩细胞核的巨噬细胞数量和细胞凋亡率相对于12μM次砷酸钠组都有显著回复。结论:砷能够促进THP-1巨噬细胞内NADPH氧化酶的装配,促进ROS的生成,诱导氧化应激,从而增加ABCA1基因启动子区DNA的甲基化程度,抑制巨噬细胞内ABCA1基因和蛋白的表达,导致巨噬细胞内脂质富集增加,胆固醇流出降低,最终诱导细胞凋亡。