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研究目的(1)PLAC8在不同物种的胚胎发育中具有重要的作用,并且前期研究发现在人类早期胚胎发育的各个时期中均有PLAC8蛋白的表达,然而在人类胚胎发育过程中具体作用仍然未知,因此我们通过构建慢病毒PLAC8敲降载体转染临床上废弃的人类早期胚胎,探讨PLAC8对人胚胎发育的影响。进一步,在细胞水平上探讨PLAC8对人胚胎干细胞的作用机制。(2)前期研究发现PLAC8在人类囊胚体外植入过程中也有表达,并与胚胎的植入状态相关,在植入状态良好的情况下PLAC8表达量高,反之,PLAC8表达量低。本研究则探讨PLAC8对胚胎植入过程的具体影响。研究方法研究一我们通过创建可以转录出敲降PLAC8 m RNA表达的sh RNA慢病毒载体来下调PLAC8表达水平。通过转染小鼠胚胎来确定最适转染滴度。再利用确定好的最适慢病毒滴度转染临床上废弃的早期3PN胚胎,观察对其胚胎卵裂率的影响。进一步,在细胞水平上探讨PLAC8对人胚胎干细胞(h ESCs)的作用机制;通过慢病毒载体感染h ESCs细胞,实时荧光定量PCR(q PCR)和Western Blot(WB)检测PLAC8空载体组、敲降组转染人胚胎干细胞的效率;采用q PCR检测转染慢病毒后人胚胎干细胞增殖相关基因的相对表达情况;利用Western Blot分析细胞增殖marker蛋白的表达情况;进一步利用流式细胞仪检测敲降PLAC8对人胚胎干细胞(h ESCs)凋亡的影响。研究二本实验首先构建PLAC8 RNAi的慢病毒载体;通过体外受精实验获得鼠胎,收集发育至囊胚期的的鼠胚;设置慢病毒滴度分别为1×10~4TU/ml,1×10~5TU/ml,1×10~6TU/ml,1×10~7TU/ml,1×10~8TU/ml转染囊胚,明确最佳感染囊胚的慢病毒滴度;最后运用小鼠胚胎子宫移植技术,把经过慢病毒转染过的囊胚移植到假孕母鼠体内,2.5天后处死观察胚胎在子宫中的植入情况。研究结果研究一成功构建了PLAC8的慢病毒敲降体系;慢病毒可以成功转染鼠胚和人类早期胚胎,使用1×10~7TU/ml诱导PLAC8 RNAi的慢病毒载体感染3PN的第2-3天胚胎,敲降组胚胎卵裂率(6.5)较阴性对照组(空载体组)显著降低(10.57±1.87);敲降组胚胎停止发育率(86%)显著高于阴性对照组(53%)。慢病毒干扰载体成功转染人胚胎干细胞h ESCs,以GAPDH为内参,阴性对照组与敲降组的PLAC8 m RNA的相对表达量分别是1.00±0.06,0.41±0.06,敲降组PLAC8m RNA表达量低于阴性对照组(P<0.05),具有统计学意义;Western blot实验结果显示:内参基因是β-actin,敲降组表达下调,进一步证明慢病毒介导干扰质粒能敲降PLAC8蛋白表达。敲降组与阴性对照组相比细胞增殖相关的基因CCND1和Ki67均下调,内参基因是GAPDH,敲降组的CCND1m RNA和ki67m RNA的相对表达量分别是0.46±0.088和0.41±0.174,具有统计学意义;同时敲降组较阴性对照组cyclin D1、PCNA蛋白下调,β-actin为内参蛋白,阴性对照组和敲降组的cyclin D1蛋白表达量分别1.32±0.18和0.78±0.11,PCNA蛋白表达量分别是1.69±0.11和1.41±0.08,经分析差异具有统计学意义。流式细胞术检测敲降组凋亡率比阴性对照组增高。研究二成功收集经过体外受精后的囊胚;经过实验发现运用慢病毒的滴度在1×10~7TU/ml转染囊胚最合适;成功的把转染后的囊胚移植到小鼠的子宫内,2.5天后发现PLAC8敲降组囊胚附植率低于阴性对照组。研究结论1.首次通过构建PLAC8 RNAi的慢病毒载体感染人类早期发育的胚胎。2.证实了PLAC8影响早期胚胎的发育,敲降早期胚胎的PLAC8基因的表达降低了胚胎的卵裂率。3.细胞实验进一步验证敲降人胚胎干细胞PLAC8基因的表达,会降低细胞增殖表达并促进细胞凋亡。4.敲降囊胚的PLAC8基因表达会导致胚胎的附植率降低。