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随着全球能源需求的日益增长,纤维素作为仅次于四大能源的可再生生物质能源,其生物转化问题一直受到国内外的高度关注。纤维素具有致密且复杂的结晶结构,单一的纤维素酶无法实现对纤维素的有效降解。因此,对多种酶构成的复杂的纤维素降解酶系的研究就变得尤为重要。本实验前期筛选出了一株具有高效纤维素降解能力的真菌Arthrobotrys sp.CX1,该菌株可以在以纤维素为碳源诱导的条件下大量表达纤维素降解相关蛋白。本课题首先利用凝胶电泳技术分析不同底物诱导条件下的CX1菌株胞外分泌蛋白的差异性并通过分级洗脱优化筛选Arthrobotrys sp.CX1在滤纸诱导培养基中的强结合纤维素蛋白。再结合液相色谱-质谱鉴定技术与生物信息学分析技术对有明显差异性的实验样本进行分析鉴定。最后,从得到的质谱结果中筛选出一些有代表性的纤维素降解相关蛋白,通过荧光定量PCR技术分析这些蛋白在纤维素降解过程中表达量的变化。实验结果表明:(1)在滤纸诱导培养基和葡萄糖培养基条件下,CX1菌株所表达的胞外蛋白存在显著的差异性。随着培养时间的延长,葡萄糖培养基中的蛋白只有表达量的增长但无蛋白表达的差异,且其蛋白条带均较为单一。而滤纸诱导培养基中随着培养时间的延长,CX1胞外分泌蛋白种类有显著变化,在培养第四天时出现了大量的差异蛋白条带,这些差异蛋白条带分子量大小均在30KDa-90KDa之间,并且均不是单一的蛋白条带。在随后对滤纸诱导培养基中底物的研究中发现,大量蛋白会吸附在底物上且多数吸附蛋白具有很强的结合能力。(2)采用分级洗脱的方法对滤纸诱导培养基底物上的强结合蛋白进行分离筛选后发现,洗脱液再作用滤纸后,滤纸相对于水洗结合超声的方法,8M尿素结合超声的方法可以更有效地分离强结合蛋白。而Triton X-100作为一种表面活性剂虽然可以更好地洗脱强结合力蛋白,但因其无法进入质谱且很难被除去,不适合作为本次实验的洗脱液。此外,在8M尿素结合超声的分级洗脱方法的优化中发现,对8M尿素洗脱液再作用滤纸后底物的进一步分级洗脱可以更有效地分离并筛选强结合蛋白。(3)采用优化后的分级洗脱方法对滤纸诱导培养基底物上强结合蛋白的分级筛选的实验样本进行质谱分析后也证明,该方法可以有效地分离和筛选结合力较强的纤维素蛋白。在分离过程中能有效减弱高丰度蛋白的显著影响,从而找到更多对纤维素降解起到重要作用的相关蛋白。(4)以葡萄糖培养基作为对照,利用实时荧光定量PCR技术对滤纸诱导培养基和微晶纤维素诱导培养基中内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、辅酶LPMO以及与纤维素降解途径有关的代谢酶如磷酸甘油酸激酶、转醛醇酶、CoA乙酰转移酶、烯醇酶等八种蛋白基因的相对表达量变化进行研究。研究发现,外切葡聚糖酶及LPMO酶在两种培养基中均有显著上调,且在微晶纤维素诱导培养基中相对表达量更高。内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶只在微晶纤维素诱导培养基中有显著上调。该结果表明,与只含有结晶型纤维素的微晶纤维素相比结构中同时存在结晶型纤维素和非结晶型纤维素的滤纸更难被降解。因此内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等三种主要纤维素降解酶的表达均被大幅度诱导提高。而裂解性多糖单加氧酶作为一种纤维素降解辅助酶,其相对表达量也远远高于滤纸诱导培养基。4种糖代谢途径酶,除转醛醇酶在滤纸诱导培养基中有一定上调外,其余三种均为显著下调,且微晶纤维素诱导培养基中几种代谢酶相对表达量低于滤纸诱导培养基。说明葡萄糖作为碳源比纤维素更容易被菌体所利用,因此与糖代谢有关的基因在纤维素诱导培养基中的表达量均低于葡萄糖培养基。而微晶纤维素的结晶结构比滤纸更为致密,也更难实现降解,其培养基中菌株对单糖的利用率低于滤纸诱导培养基,所以几种与糖代谢相关基因的相对表达量也更低。本课题研究有助于深入了解纤维素降解过程中相关蛋白的种类、功能及其作用机理,进一步提高对Arthrobotrys sp.CX1酶系组分的认识,为后续纤维素降解酶系的优化和纤维素的高效生物转化提供有利依据。