过敏性疾病是一种常见疾病,其临床表现有很多种,包括过敏性哮喘、过敏性休克、过敏性紫癜、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等。过敏性疾病是由Ⅰ型超敏反应引起的,其主要中间物质为IgE及其高亲和力受体（FcεRⅠ）。过敏原第一次侵入机体,可以诱导B淋巴细胞产生抗原特异性IgE,IgE与靶细胞表面的高亲和力受体结合以后,当相同抗原再次侵入机体时,就可以引发靶细胞内的一系列信号转导,使靶细胞释放组胺等生物活性物质,引起过敏性炎症反应。Ⅰ型变态反应性疾病,包括哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎及食物过敏等,在过去的20年中发病率逐年上升,全世界约有1.0～1.5亿人患有哮喘,每年可导致约18万人死亡。估计全球为防治哮喘的经济代价已超过用于结核病和艾滋病的总和。目前,比较成熟的抗过敏疗法及脱敏疗法,仅以抗炎和缓解症状为目标,且存在较严重的副反应,治疗效果也不满意。因此,寻找更新、更特异的治疗途径是当务之急。引起Ⅰ型超敏反应的物质称为过敏原,我们生活中的一些高蛋白食物、屋尘、花粉、真菌、人与动物皮毛、羽毛、昆虫、寄生虫、药物及其他化学物质等都可作为过敏原,通过吸入、食入、注射或接触使机体致敏。过敏原侵入机体后,鼻咽、扁桃体、支气管、胃肠粘膜等处固有层的浆细胞产生抗原特异性IgE,IgE通过与嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的IgE高亲和力受体（FcεRⅠ）结合,使靶细胞处于致敏状态。IgE与其高亲和力受体FcεRⅠ之间的相互作用是引发抗寄生虫免疫和过敏反应的关键步骤。最近对受体、IgE-Fc以及IgE-Fc:FcεRⅠ复合物的结构研究显示了IgE及其受体这两种蛋白是怎样相互作用以引发肥大细胞对抗原进行应答反应。IgE-Fc:FcεRⅠ复合物的晶体结构阐明了抗体和受体形成1:1复合物的机理是受体结合抗体Fc段二聚体的每一条链。IgE-Fc在未结合受体时的结构显示了IgE内部可能到影响受体结合的大规模构象重排的潜力。IgE与其高亲和力受体FcεRⅠ之间的相互作用是过敏反应发生发展过程中关键性的步骤。对IgE-FcεRⅠ相互作用的详细特征描述可能洞察到抑制这种作用的可能性模式,进而可以为过敏反应提供潜在的治疗方法。受体两个不同的结合表面形成凸出的且不对称相互作用表面分别与两个Cε3决定域结合,形成两个相互结合的位点。位点一:由IgE一条重链上Cε3决定域的十二个氨基酸残基和受体上的八个氨基酸残基构成,IgE残基来自IgE-Fc序列的四个不同的区域,包括:Cε3-Cε3衔接区（334-336位残基）,BCloop（362-365）,DE loop（393-396）以及FG loop（424位残基）,受体残基来自于D2决定域的两个区域:C带（117,119和121位残基）和C’-E区（126和129-132位残基）。横跨位点一表面有两个潜在的盐桥（αK117- Cε3D362以及αE132-Cε3R334）和四个潜在的氢键连接（αK117- Cε3G335,αY129- Cε3D362,αY131-Cε3D364,αY131- Cε3R334）。受体上的Y131残基镶嵌进由IgE-Fc中Cε3中BC和FG loop以及cε2-cε3衔接区形成的口袋里。位点二:包括来自IgE的十个氨基酸残基和来自FcεRIα的八个氨基酸残基。IgE残基局限于Cε3决定域的两个不同的区域:Cε2-Cε3衔接区（332-337位残基）和FG loop（424-427位残基）。FcεRIα残基来自三个区域:D1-D2连接区（85-87）;D2 BC loop（110-113位残基）以及D2 FG loop（156-158）.受体的D1决定域不直接与IgE-Fc相互作用。位点二主要包括三个疏水性氨基酸,它们以三个潜在的与IgE-Fc相连接的氢键横跨复合物相互作用表面。（αW156- Cε3G335,αQ157- Cε3N332,αQ157- Cε3R334）。IgE-Fc的P426嵌入到受体残基W87和W110之间,形成疏水性脯氨酸夹心。IgE/FcεRⅠ复合物晶体结构显示许多相互作用位点是由位于Cε3展开的氨基末端区域和Loop直接与受体接触构成。IgE Fc的Cε2决定域朝向Cε3区剧烈且不对称弯曲使Cε3具备了一个易接近位点和一个隐藏的位点。完整的包含Cε2决定域的IgE Fc晶体结构显示单体的IgE Fc中两个亚位点中只有一个是易接近的,这就需要发生构象上的改变以使第二个位点与IgE Fc结合。FcεRⅠα链与2个CH3均有CH2-CH3接头（linker）的残基在受体的顶端形成1个不对称的拱形结构。当特异性抗原与靶细胞上两个以上的IgE分子结合,通过桥联反应,使两个以上的IgE分子靠近并发生构型改变。然后,交联的FcεRⅠ可激活两种胞浆内蛋白激酶（Lyn和Syk）,使之磷酸化而激活。最后,接头蛋白和GTP交换因子/GTP酶诱导胞内贮存的Ca²⁺释放。后者再促进细胞脱颗粒、释放血管活性物质及某些酶类,即可出现过敏反应。鉴于过敏性疾病病人外周血淋巴细胞表达IgE含量比正常人增多,用RT-PCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞调取IgE Cε3-Cε4 cDNA片段,克隆至pET28a（+）构建原核表达载体IgE Cε3-Cε4-pET28a（+）,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）,诱导表达IgE Cε3-Cε4区蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白后,用免疫荧光方法鉴定重组蛋白与天然细胞表面受体FcεRⅠ之间的结合能力,并用UniCAP 100全自动分析检测仪对重组抗原进行定量检测与鉴定;用表达蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗鼠血清,用Western blot法对多克隆抗体进行鉴定。结果显示,测序表明成功调取的人IgE Cε3-Cε4区基因,与已报道的序列相一致;获得的IgE Cε3-Cε4区蛋白经SDS-PAGE鉴定显示,其相对分子质量（M r）同预期的结果相一致;通过细胞免疫荧光实验证实,IgE Cε3-Cε4能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεRⅠ受体;通过UniCAP 100全自动分析检测仪能够检测到重组抗原并精确到国际单位;用Western blot方法证实免疫鼠血清多抗能特异性结合天然人血清IgE。重组质粒IgE Cε3-Cε4-pET28a（+）在大肠杆菌中表达出重组蛋白,经过表达条件的优化,表达产物主要以非可溶性形式存在。重组蛋白分子量约为30kDa,表达量约占菌体总蛋白的60%。利用亲和层析法纯化重组蛋白,纯度达80%。用Ni亲和层析柱对蛋白进行纯化,表明该蛋白确实是所要表达的His融合蛋白。通过细胞免疫荧光实验证实,IgE Cε3-Cε4能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεRⅠ受体;通过UniCAP 100全自动分析检测仪能够检测到重组抗原并精确到国际单位。用表达蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗鼠血清,用Western blot法对多克隆抗体进行鉴定。以上结果表明,我们已经成功地构建了IgE Cε3-Cε4- pET28a（+）原核重组表达质粒,而且在大肠杆菌中大量表达出具有免疫活性的重组蛋白,并用天然人血清IgE鉴定了多克隆抗体。为进一步研究该蛋白的功能、单克隆抗体的制备、在人过敏性疾病的发生及其信号转导、对过敏性疾病的治疗奠定基础。