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研究背景糖尿病肾脏病(Diabetic Kidney Disease,DKD)是糖尿病患者最重要的微血管并发症之一,是西方国家发生终末期肾病(End stagerenaldisease,ESRD)的主要原因。既往研究认为糖尿病肾脏病主要是因为高糖状态下肾小球的病变导致蛋白尿的产生。虽然肾小球的变化很重要,但有研究提示肾小管不仅可以负反馈肾小球,从而影响肾小球病变,而且由于肾小管更易受血流动力学的影响,因此更易发生病变。因此,着力于研究肾小管病变对DKD的影响对延缓其进展有着关键作用。肾脏疾病的进展形式表现出共同的病理过程,如纤维化和肾细胞凋亡。易受多种代谢和血流动力学因素影响的肾近端小管对于细胞凋亡起关键作用。凋亡是多基因严格控制的过程,这些基因在种属之间非常保守,如Bc1-2家族、caspase家族等。Bc1-2家族中的Bc1-2是第一个被发现的公认的抗凋亡因子,它能抑制Caspase-3的活化,阻止细胞凋亡。近年微小RNA(microRNA,miRNA)是一种内源性的长约22个碱基的短链非编码RNA,其在DKD发生发展过程中的重要作用引起了广泛关注。研究已证实miRNA在细胞增殖、分化和细胞凋亡等多种生理和病理过程发挥调控作用。目前,在人类基因组中发现超过2000个miRNAs,并且已有研究表明miRNA与糖尿病肾脏病相关,如miR-30c、miR-26a。课题组前期对2型糖尿病肾脏病患者尿液外泌体microRNA差异表达谱分析,结果提示DKD患者较2型糖尿病患者的miR-877-3p升高4.26倍。近年来的研究也表明miR-877-3p既可以影响IgA肾病进展,也可以抑制细胞增殖。但是在DKD进程中,缺乏关于miR-877-3p的研究,因此本研究旨在探索糖尿病肾脏病中miR-877-3p对肾小管上皮细胞凋亡的作用以及可能的机制。方法1.动物实验采用课题组前期用STZ联合高脂饲料诱导的C57BL/6J小鼠(n=12)糖尿病肾脏病模型,同时以正常小鼠(n=12)作为对照组。运用6W、12W糖尿病组和对照组小鼠,其中肾脏组织冻存于-80℃。2.细胞培养人肾小管上皮细胞株(HK-2)是从上海中国科学院细胞库取得,于含10%FBS的1.0g/L葡萄糖的DMEM培养基中培养,在37℃含5%C02潮湿大气中孵育。培养基每48h换一次。3.细胞转染(1)miRNA类似物(mimic)和抑制剂(inhibitor)转染转染前一天,细胞接种于12孔板中,转染时细胞密度达到70%-80%。lipO3000用于瞬时转染(根据lipo3000转染试剂的说明书操作)。miRNA的mimic和inhibitor转染浓度均为50nM。(2)质粒和mimic共转转染前一天,细胞接种于24孔板中,转染时细胞密度达到70%-80%。lipO3000用于瞬时转染(根据lipo3000转染试的剂说明书操作)。24孔板中mimic的转染浓度为50nM,荧光素酶报告基因质粒转染量为1μg。4.RNA提取、逆转录和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)用Trigol提取小鼠肾组织和HK-2细胞总RNA。RNA逆转录用M-MLV逆转录酶试剂。使用SYBR法进行实时荧光定量PCR检测基因表达水平。通过2-△△Ct方法计算每个基因的相对值,以GAPDH为内参。5.Western Blot用RIPA裂解液提取肾组织和HK-2细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。配制12%的SDS-PAGE胶,每孔蛋白上样量为20μg。电泳分离样品蛋白后湿转到PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉封闭PVDF膜,一抗稀释后与PVDF膜在4℃摇床上过夜。用TBST缓冲液洗膜后加入二抗(1:5000)室温孵育2h。再次置于TBST中洗涤后,用增强化学发光液显色并扫描结果,用Image J软件分析目标条带灰度值。6.双荧光素酶报告基因实验分别构建野生型和突变型Bcl-2的3’UTR区载体。用Promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定RLU值。7.统计分析用SPSS 20.0统计软件进行数据分析,结果均以均数±标准误(x±SEM)表示。符合正态分布的两个独立样本均数的比较采用t检验,多个样本均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),其中方差齐的数据采用最小显著性差异(LSD)法进行比较,方差不齐的数据采用Welch法进行近似方差分析。P<0.05视为差异具有统计学意义。结果1.miR-877-3p在STZ联合高脂饲料诱导的DM小鼠肾皮质中表达水平的变化研究与对照组相比,DM组小鼠肾皮质中miR-877-3p表达水平6W时明显升高,12W时进一步升高。这表明miR-877-3p可能参与DKD的进程。2.miR-877-3p在高糖诱导的HK-2细胞中的表达变化HK-2细胞中miR-877-3p的表达水平随着30mmol/L高糖刺激时间的延长逐步上调,在48h达到高峰。这进一步表明miR-877-3p可能参与DKD的发病进程。3.miR-877-3p通过直接调控靶基因Bc1-2诱导细胞凋亡1)靶基因鉴定a)TargetScan生物信息学软件预测Bc1-2基因3’UTR区中含有miR-877-3p的结合位点,荧光素酶报告基因实验证实了 miR-877-3p靶作用于Bc1-2。b)qRT-PCR检测证明转染miR-877-3p的mimic下调Bc1-2的表达,并且Bc1-2/Bax比严重下降;转染miR-877-3p的inhibitor上调Bc1-2的表达,并且Bc1-2/Bax比上升。2)miR-877-3p调控HK-2细胞凋亡a)qRT-PCR证明:在30mmol/L高糖的情况下,转染miR-877-3p的inhibitor下上调Bc1-2。当加入si-Bc1-2后可以逆转Bc1-2 mRNA的表达。结论1.早期DKD小鼠肾皮质中miR-877-3p表达升高。2.高糖对HK-2细胞中miR-877-3p表达的促进作用呈时间依赖性,miR-877-3p对肾小管上皮细胞凋亡具有促进作用。3.荧光素酶报告基因实验证实miR-877-3p靶作用于Bc1-2;过表达miR-877-3p下调Bc1-2表达,上调Bax表达。4.miR-877-3p通过使Bc1-2/Bax失衡调控线粒体途径诱导细胞凋亡。