猴头菌子实体多糖提取及体外抗胃癌活性研究

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猴头菌作为珍贵的药食两用真菌,具有极其丰富的生物活性,本课题对猴头菌子实体粗多糖进行分离和纯化,分析猴头菌水溶性多糖的糖苷键特点、成分以及单糖组分。同时,选择胃癌这种消化道系统中高发性恶性肿瘤为研究对象,从胃癌细胞(SGC-7901)的增殖、凋亡、迁移三个方面,对猴头菌水溶性多糖的抗肿瘤活性以及与化疗药物顺铂(DDP)联合作用效果进行探究。首先,猴头菌子实体粗多糖提取条件的优化采用L9(34)正交试验,确定猴头菌子实体粗多糖在料液比为1:60,乙醇终浓度为70%,提取温度为90℃,提取时间为2 h时,提取率最高为8.37%±0.58%。然后,采用Sevage法去除醇沉后获得的猴头菌粗多糖中的蛋白质,Bradford法确定蛋白质含量,蛋白质去除率达到90.26%±1.94%,苯酚硫酸法检测了脱蛋白后猴头菌的糖含量为73.92%±1.26%。除蛋白后的猴头菌多糖混合物(H.erinaceus fruiting bodies mixture polysaccharide,HFPM)通过DEAE-52离子交换柱层析进行进一步提纯,获得4个洗脱峰,其中HFPM2对SGC-7901的抑制效果最为明显,作用48 h的IC50值为626.52μg/mL±2.32μg/mL。因此,接下来通过Sephadex G-200对HFPM2进行下一步纯化,得到组分均一的纯化猴头菌子实体多糖(H.erinaceus fruiting bodies polysaccharide,HFP)。接着对HFP组成成分进行了探究。在HFP中没有检测到蛋白含量,HFP总糖含量为91.05%±0.16%,糖醛酸含量为4.26%±0.23%,是一种酸性多糖。采用三氟乙酸法水解HFP,水解产物PMP柱前衍生,毛细管电泳法分析HFP单糖组成,获得Xyl,Rha,Glc,Glu A四种单糖,各单糖比例为2.8:2.2:5.1:1.0。最后,探究HFP处理胃癌SGC-7901细胞作用效果。通过实验证明,HFP对SGC-7901细胞的增殖有抑制作用,当HFP作用浓度越高、作用时间越长时,对SGC-7901的抑制效果也随之增强。并且在50μg/mL时差异出现显著性,200μg/mL时出现差异极显著性。48 h时IC50值为361.78μg/mL±5.49μg/mL。并且与低剂量的DDP联合作用下也有明显的作用。通过形态学上的观察,并且对Caspase酶活性的检测,以及探究Bax,Bcl-2的mRNA表达,HFP可以引起SGC-7901细胞的凋亡。划痕试验表明,对照组细胞在24 h较易愈合,而实验组细胞呈剂量依赖性抑制划痕的闭合,检测MMP-2,9的mRNA表达,HFP能抑制SGC-7901细胞中MMP-2,9的mRNA表达。因此,HFP可以有效的抑制细胞迁移。本文对猴头菌子实体多糖进行探究,证明猴头菌子实体多糖具有较好的抗胃癌活性,是一种具有良好开发前景的真菌。
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