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肿瘤细胞的能量代谢明显高于正常细胞以维持它们较高的生长速率和增殖侵袭需要。人表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2,ErbB2或HER2)基因在多种恶性肿瘤中存在高表达,而在乳腺癌中ErbB2基因高表达的比率较其他种类癌组织高。高表达ErbB2导致葡萄糖代谢和摄取的增加,乳酸增加以及耗氧量的降低。而高表达ErbB2的乳腺癌细胞更容易对ErbB2的分子靶向药物赫赛汀形成耐药。通过抑制高表达ErbB2的乳腺癌细胞的糖酵解过程可能诱导乳腺癌细胞的凋亡,这有望成为乳腺癌治疗的新靶点。而3-溴化丙酮酸(3-Bromopyruvate,3-BrPA)作为一种糖酵解抑制剂,选择性的作用于糖酵解过程的关键酶己糖激酶HKⅡ(hexokinase II,HKⅡ),能诱导多种肿瘤细胞凋亡,而我们的研究证实基于这一原理,为高表达ErbB2乳腺癌寻找一种新的靶向治疗药物。目的:通过建立高表达和低表达ErbB2的三种乳腺癌细胞系,利用Western blot法、线粒体分离、JC-1线粒体膜电位检测、异种移植体内实验等方法,研究ErbB2基因在3-BrPA治疗中抑制乳腺癌细胞活性的能力,对HKⅡ蛋白表达活性和线粒体分布的影响。应用HKⅡ抑制剂3-BrPA后,观察高表达ErbB2的乳腺癌细胞活力变化,探讨3-BrPA诱导高表达ErbB2的乳腺癌细胞凋亡以及对异种移植乳腺癌成瘤抑制的相关机制。方法:1.对正常情况下低表达ErbB2基因的人乳腺癌细胞株MCF7、MDA-MB-231进行野生型ErbB2转染,对高表达ErbB2基因的BT474人乳腺癌细胞进行ErbB2 si RNA转染,建立高表达ErbB2的231ErbB2、MCF7ErbB2两种细胞株和低表达ErbB2的BT474 si ErbB2细胞株,Western blot法检测三种乳腺癌细胞株中ErbB2的表达情况,测定给予3-BrPA处理后48h各组细胞的活力。2.Western blot法分析HKⅡ在三种细胞株中表达变化以及在线粒体和胞浆的分布变化。3.Western blot法分析,给予3-BrPA对高表达ErbB2的乳腺癌细胞中HKⅡ在线粒体和胞浆中的表达变化,观察HKⅡ从线粒体解离的量。4.通过JC-1线粒体荧光探针检测线粒体膜电位变化,Western blot法分析细胞色素C在线粒体和胞浆中分布变化以及PARP蛋白裂解情况,观察3-BrPA诱导高表达ErbB2的乳腺癌细胞凋亡的情况。5.异种移植试验应用231V,231ErbB2两种乳腺癌细胞接种裸鼠,观察3-BrPA对高表达ErbB2的乳腺癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用。结果:1.成功建立了稳定表达的高表达ErbB2的231ErbB2、MCF7ErbB2两种细胞株和低表达ErbB2的BT474 si ErbB2细胞株,并用Western blot法检测了ErbB2的表达情况。测定给予3-BrPA后48h各组细胞的活力,发现3-BrPA使高表达ErbB2的细胞活力明显下降、凋亡情况明显增加。2.Western blot法分析发现HKⅡ在高表达ErbB2的细胞中表达明显增加且大部分在线粒体中分布,而在低表达ErbB2的细胞中无明显变化。己糖激酶比色法发现高表达ErbB2的细胞HKⅡ活性增加。3.Western blot法分析给予3-BrPA后发现高表达ErbB2的乳腺癌细胞中的HKⅡ在线粒体中明显减少,而在胞浆中明显增多,说明HKⅡ从线粒体解离。4.JC-1线粒体膜电位检测给予3-BrPA后高表达ErbB2的乳腺癌细胞线粒体膜电位显著降低,Western blot法分析细胞色素C在线粒体中的含量明显减少而在胞浆中明显增多,PARP的裂解显著增多,说明3-BrPA诱导了高表达ErbB2的乳腺癌细胞的凋亡。5.异种移植试验对乳腺癌荷瘤裸鼠给予3-BrPA后高表达ErbB2的荷瘤裸鼠中可观察到明显的成瘤抑制作用。结论与创新:1.成功建立了高、低表达ErbB2的乳腺癌细胞模型,细胞活力测试发现高表达ErbB2的乳腺癌细胞对3-BrPA更敏感。2.ErbB2基因的高表达与HKⅡ在线粒体中分布增加相关,首次提出ErbB2表达与HKⅡ表达之间的相关性。3.3-BrPA促进了高表达ErbB2的乳腺癌细胞中HKⅡ从线粒体的解离,证实了3-BrPA对高表达ErbB2乳腺癌细胞生长抑制作用的机制。4.进一步研究发现3-BrPA导致肿瘤细胞生长受抑制机制在于降低了线粒体膜电位,使细胞色素C从线粒体向胞浆释放以及PARP裂解,诱导了线粒体介导的凋亡。5.在体内实验中3-BrPA对高表达ErbB2的荷瘤裸鼠具有抑瘤作用。为针对高表达ErbB2的乳腺癌的特异性靶向治疗药物3-BrPA提供了研发前景。