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背景和目的寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)属于黄病毒科黄病毒属病毒,最早于1947年首次分离于非洲恒河猴,全球有过数次ZIKV感染暴发流行。2016年我国也确诊了 ZIKV输入性感染病例。中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)首次于2012年在沙特阿拉伯发现,起初因其临床症状与重症急性呼吸综合征(SARS)相似,所以也称为“类SARS-CoV病毒”。MERS-CoV感染主要流行于中东地区,欧亚、北美也先后有感染病例,且均和中东有着直接或者间接的关系,死亡率高达35%。我国于2015年首次确诊了一例由韩国输入的MERS病人。随着全球化进一步扩大,以上两种新发传染病均有可能在我国流行,甚至暴发,可能带来极大的经济和疾病负担,是可能面临的重大公共卫生问题之一。因此,建立相关的快速血清学检测方法对于防止疾病流行具有重要意义。荧光素酶免疫吸附方法(Luciferase immunosorbent assay,LISA)是本实验室建立的依赖于新型荧光素酶——Nano-luciferase的高通量、高灵敏度的抗体检测方法,具有简单,快速,灵敏度高,不需要特异性种属第二抗体的优点。本实验室已经将其运用于抗HIV抗体的检测并取得了良好的效果。本课题研究的目的是基于LISA平台,建立新的检测抗ZIKV和抗MERS-CoV抗体的检测方法。研究方法确定ZIKV的NS1和NS2B蛋白以及MERS-CoV的S1、S2、RBD、NTD和NP蛋白作为检测抗原,构建相关荧光素酶表达质粒,转染至293T细胞表达荧光素酶-目标抗原融合蛋白,收集获得的含有融合抗原的细胞裂解物用以建立相关LISA方法。以Protein G固定于固相载体表面作为捕捉抗体分子,加入待测样本一起孵育,捕获样本中总的IgG抗体。加入表达细胞表达荧光素酶-目标抗原融合蛋白的细胞裂解物,目标抗原与固相载体表面的特异性抗体结合依附于固相载体,洗去多余裂解物后加入荧光素酶底物反应。检测荧光强度以此确定待测样本中特异性抗体的存在及浓度。收集不同来源的人以及动物血清样本,与ZIKV和MERS-CoV抗体商业化试剂盒检测结果进行对比,评价所建立的LISA方法的灵敏度以及特异度。研究结果本研究确定了ZIKV的NS1蛋白的羧基端(C-NS1)作为寨卡病毒的最佳检测抗原,建立了相关的抗体检测方法。C-NS1-LISA检测结果与微量中和实验结果吻合,灵敏度比商用ELISA试剂盒高4倍以上。但与黄病毒属其他病毒感染样本存在一定的交叉反应,假阳性率分别为:登革病毒(DENV)8.5%(4/47),日本脑炎病毒(JEV)0%(0/6),黄热病病毒(YFV)20%(2/10),丙型肝炎病毒(HCV)0%(0/10);与披膜病毒科基孔肯雅热病毒(CHIKV)的交叉反应发生率为33%(3/9)。但是,ZIKV NS1和NS2B抗原联合使用,检测结果的假阳性率分别为:登革病毒(DENV)2%(1/47),日本脑炎病毒(JEV)0%(0/6),黄热病病毒(YFV)0%(0/10),丙型肝炎病毒(HCV)0%(0/10),基孔肯雅热病毒(CHIKV)11%(1/9),可以显著提高检测方法的特异性。此外,确定了MERS-RBD,MERS-S1,MERS-NP蛋白可以作为MERS-CoV抗体检测方法的目标抗原,其中RBD效果最好,检测结果与商用ELISA试剂盒和假病毒中和实验结果吻合,灵敏度比商用ELISA试剂盒高16倍。所建立的两种病毒的LISA检测方法均可用于人或其他不同种属动物样本检测。