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热休克蛋白70(Heatshockproteins,Hsp70s)是从细菌到哺乳动物中均广泛存在的一类保守的蛋白质家族。Hsp70s不仅在应激条件(如:热应激、饥饿或者细菌感染)下高效表达,有些还可以在正常的生理条件下有组成型的表达。诱导型的热休克蛋白70家族成员(Heatshockproteins,Hsp70s)是应激时大量表达的诱导性产物;组成型的热休克蛋白70称为热休克相关蛋白(heatshockcognateproteins,Hsc70s),除了可以进行应激性表达外,也可以进行组成性表达,它们是参与热休克反应(HeatShockResponds,HSR)的主要因子。
Hsp70s家族通常含有多个成员。对于人类,果蝇和酵母等物种的Hsp70s目前已经有了较详细的研究,人的基因组含有17个Hsp70s基因和30个假基因,诱导性表达的成员有Hsp70-1a、Hsp70-1b、Hsp70-1t、Hsp70-6等,组成型表达的成员有Hsp70-5、Hsp70-9等;果蝇Hsp70s家族至少有12个成员,诱导性的有Hsp68和Hsp70s,组成型成员有Hsc70-1、Hsc70-2、Hsc70-4、Hsc70-3等。2009年,FabianM对位于果蝇内质网内的Hsc70-3做了定量表达分析,发现在热激过程中,Hsc70-3的表达量增加了。在不同的物种中,随着Hsp70s成员不同,其表达的数量和功能也可能不同,在热激过程中的表达情况也不尽相同。目前,家蚕Hsp7s0家族成员的报道尚属空白,各成员的热激表达也缺乏研究,所以有必要对家蚕Hsp70s家族的组成及基因成员的表达情况进行探索。
本研究首先利用电子克隆技术,在EST数据库中人工拼接家蚕Hsp70家族成员,然后克隆、测序Hsp70s家族的每一个成员,根据和其它物种的比对结果,参照其命名原则,对家蚕Hsp70s家族成员进行了命名,并对其进行了染色体定位分析。家蚕内至少有10个Hsp70s家族成员,其中,Hsp70A、Hsp70B、Hsp68和Hsp70-14在基因组上都没有内含子,为诱导型。Hsp70,Hsp70A和Hsp70B分布在家蚕第27号染色体上,在基因组上是串连的,有多个拷贝,但是方向相反。Hsp70-14是一个分子量只有52KD的蛋白质,没有C末端的基序,是一个不规范的Hsp70。Hsc70-4、Hsc70-3、Hsc70-5、Hsc70-2、Hsc70-cs和Hsc70Cb在基因组上都含有内含子,属于组成型表达的Hsp70,其中Hsc70-3是内质网内组成型表达的热休克蛋白,Hsc70-4是细胞质内组成型表达的一种热休克蛋白。此外,在家蚕的11号染色体上,有一个暂命名为Hsp70-w的假基因,它在基因组上存在,也有转录(CK517125),但成熟的mRNA不能翻译出正确的蛋白质,所以Hsp70-w是一个有转录的假基因。Hsc70s家族成员则分布在不同的染色体上,一般只有一个拷贝。
家蚕是鳞翅目昆虫的模式物种,也是我国养殖了几千年的经济昆虫,基因库里保存有大量不同性状的品系的基因信息,为本研究提供了较丰富的材料。本研究团队筛选了抗热家蚕品系cs-10,不抗热的温度敏感性品系cs-11和以抗性品系和感性品系为亲本构建的近等基因系cs-7。以这三种家蚕品系作为研究材料来分析家蚕Hsp70s家族成员(Hsp68、Hsp70B、Hsc70-3和Hsc70-4)的一级序列及在高温诱导下的表达模式。本实验首先对每个品系中Hsp70s成员的转录产物进行克隆、测序。用MegAlign软件分析每个成员的一级结构,结果显示Hsp70s成员在三个品系中的一级序列排布上相似度非常高,只有极个别氨基酸不同。其次将家蚕进行40℃热激,用qRT-PCR技术对其表达量上进行了研究。诱导型的Hsp70s包括Hsp68和Hsp70B与组成型的Hsc70s包括Hsc70-3和Hsc70-4在三个品系中的表达均上调,说明这4个Hsp70s成员在三个品系中均参与了抗热,但是在不同的品系中,每个Hsp70s成员上调的情况有很大的不同。说明抗性品系能够抗热与Hsp70s的表达量有密切关系。在不同的热激时间,每个成员的表达也有很大的变化,表明各个成员虽然是属于Hsp70s家族,对热的抵御能力不尽相同,也许各个成员并不能相互替代,有其各自特殊的功能。最后用Northern杂交技术对Hsp70B和Hsc70-3在三个品系中的表达情况作了验证分析。表达趋势和荧光定量结果是一致的。本研究可以为家蚕耐热机理方面的探索打下基础,也可以为Hsp70s家族各成员不同功能方面的研究提供数据。
Hsp70s家族通常含有多个成员。对于人类,果蝇和酵母等物种的Hsp70s目前已经有了较详细的研究,人的基因组含有17个Hsp70s基因和30个假基因,诱导性表达的成员有Hsp70-1a、Hsp70-1b、Hsp70-1t、Hsp70-6等,组成型表达的成员有Hsp70-5、Hsp70-9等;果蝇Hsp70s家族至少有12个成员,诱导性的有Hsp68和Hsp70s,组成型成员有Hsc70-1、Hsc70-2、Hsc70-4、Hsc70-3等。2009年,FabianM对位于果蝇内质网内的Hsc70-3做了定量表达分析,发现在热激过程中,Hsc70-3的表达量增加了。在不同的物种中,随着Hsp70s成员不同,其表达的数量和功能也可能不同,在热激过程中的表达情况也不尽相同。目前,家蚕Hsp7s0家族成员的报道尚属空白,各成员的热激表达也缺乏研究,所以有必要对家蚕Hsp70s家族的组成及基因成员的表达情况进行探索。
本研究首先利用电子克隆技术,在EST数据库中人工拼接家蚕Hsp70家族成员,然后克隆、测序Hsp70s家族的每一个成员,根据和其它物种的比对结果,参照其命名原则,对家蚕Hsp70s家族成员进行了命名,并对其进行了染色体定位分析。家蚕内至少有10个Hsp70s家族成员,其中,Hsp70A、Hsp70B、Hsp68和Hsp70-14在基因组上都没有内含子,为诱导型。Hsp70,Hsp70A和Hsp70B分布在家蚕第27号染色体上,在基因组上是串连的,有多个拷贝,但是方向相反。Hsp70-14是一个分子量只有52KD的蛋白质,没有C末端的基序,是一个不规范的Hsp70。Hsc70-4、Hsc70-3、Hsc70-5、Hsc70-2、Hsc70-cs和Hsc70Cb在基因组上都含有内含子,属于组成型表达的Hsp70,其中Hsc70-3是内质网内组成型表达的热休克蛋白,Hsc70-4是细胞质内组成型表达的一种热休克蛋白。此外,在家蚕的11号染色体上,有一个暂命名为Hsp70-w的假基因,它在基因组上存在,也有转录(CK517125),但成熟的mRNA不能翻译出正确的蛋白质,所以Hsp70-w是一个有转录的假基因。Hsc70s家族成员则分布在不同的染色体上,一般只有一个拷贝。
家蚕是鳞翅目昆虫的模式物种,也是我国养殖了几千年的经济昆虫,基因库里保存有大量不同性状的品系的基因信息,为本研究提供了较丰富的材料。本研究团队筛选了抗热家蚕品系cs-10,不抗热的温度敏感性品系cs-11和以抗性品系和感性品系为亲本构建的近等基因系cs-7。以这三种家蚕品系作为研究材料来分析家蚕Hsp70s家族成员(Hsp68、Hsp70B、Hsc70-3和Hsc70-4)的一级序列及在高温诱导下的表达模式。本实验首先对每个品系中Hsp70s成员的转录产物进行克隆、测序。用MegAlign软件分析每个成员的一级结构,结果显示Hsp70s成员在三个品系中的一级序列排布上相似度非常高,只有极个别氨基酸不同。其次将家蚕进行40℃热激,用qRT-PCR技术对其表达量上进行了研究。诱导型的Hsp70s包括Hsp68和Hsp70B与组成型的Hsc70s包括Hsc70-3和Hsc70-4在三个品系中的表达均上调,说明这4个Hsp70s成员在三个品系中均参与了抗热,但是在不同的品系中,每个Hsp70s成员上调的情况有很大的不同。说明抗性品系能够抗热与Hsp70s的表达量有密切关系。在不同的热激时间,每个成员的表达也有很大的变化,表明各个成员虽然是属于Hsp70s家族,对热的抵御能力不尽相同,也许各个成员并不能相互替代,有其各自特殊的功能。最后用Northern杂交技术对Hsp70B和Hsc70-3在三个品系中的表达情况作了验证分析。表达趋势和荧光定量结果是一致的。本研究可以为家蚕耐热机理方面的探索打下基础,也可以为Hsp70s家族各成员不同功能方面的研究提供数据。