第一部分JTV1基因siRNA载体构建及其在K562细胞中的表达　　 目的:构建JTV1基因的siRNA重组载体,并在表达JTV1基因的K562细胞中鉴定其干扰作用。　　 方法:人工合成靶向JTV1基因的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法克隆到载体pGeneSil-1上得到重组载体pGeneSil-1-JTV1siRNA,并转染人K562细胞株,经过G418稳定筛选后,用RT-PCR法及Western Blot技术检测重组载体对K562细胞中JTV1基因转录和翻译的影响。　　 结果:成功构建了JTV1基因的siRNA载体;pGeneSil-1-JTV1siRNA载体能显著抑制K562细胞中JTV1基因的转录和翻译水平。　　 结论:构建的pGeneSil-1-JTV1 siRNA载体能有效地抑制K562细胞中JTV1基因mRNA的转录及翻译的水平,并通过G418筛选获得了JTV1基因表达受抑制的稳定K562细胞克隆。　　 第二部分抑制JTV1基因表达对K562细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究　　 目的:探讨抑制JTV1基因的表达后对人白血病K562细胞株增殖能力的影响及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、c-Myc的调节。　　 方法:将pGeneSil-1-JTVl-1.1 siRNA重组载体、pGeneSil-1-N.1阴性对照载体及pGeneSil-1空载体转染人K562细胞系。通过集落形成实验检测细胞增殖能力,FCM法分析细胞周期和细胞凋亡率,同时采用RT-PCR法检测基因JTVl及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、c-Myc转录水平的变化,Western Blot印迹法检测基因JTV1及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、c-Myc翻译水平的变化。　　 结果:集落形成实验结果显示抑制JTV1基因的表达后K562细胞的增殖能力明显增高;各组转染K562细胞经大黄素处理72h后,FCM法检测结果显示,与对照组K562细胞相比,pGeneSil-1-JTV1-1-1siRNA载体转染组K562细胞的G期细胞比例下降;RT-PCR法检测结果显示,与对照组比,pGeneSil-1-JTV1-1.1 siRNA载体转染组Bax基因的mRNA转录水平和蛋白翻译水平均明显下降;而Bcl-2基因和c-Myc基因的mRNA转录水平和蛋白翻译水平则明显上调。　　 结论:抑制JTV1基因可能通过上调基因Bcl-2和c-Myc的表达,下调基因Bax的表达,从而促进K562细胞的增殖,阻止其发生凋亡。　　 第三部分真核表达载体pcDNA3.1-JTV1的构建及其在K562细胞中的表达　　 目的:构建pcDNA3.1-JTV1真核表达载体并稳定转染人白血病K562细胞系,检测JTVl基因mRNA和蛋白的表达情况。　　 方法:用RT-PCR与DNA重组技术从外周血单个核细胞中获得JTV1基因的cDNA并将其插入pcDNA3.1-JTV1表达载体中;构建的重组质粒经脂质体转染K562细胞;用RT-PCR和Western Blot鉴定JTV1基因在K562细胞中的稳定表达。　　 结果:RT-PCR成功地扩增出一条约1200 bp左右的片段,经限制性内切酶酶切分析与DNA测序证实目的基因已插入重组质粒,RT-PCR和Western Blot结果均证明人JTV1基因能在K562细胞中稳定表达。　　 结论:成功构建了pcDNA3.1-JTV1真核表达载体,获得了稳定表达JTV1基因的K562细胞克隆。　　 第四部分JTV1对K562细胞增殖和凋亡的影响及其机制　　 目的:观察上调JTV1基因的表达对人白血病K562细胞系增殖与凋亡的影响,并通过检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、c-Myc的变化,探讨其机制。　　 方法:将携带有JTV1基因的pcDNA3.1-JTV1载体及pcDNA3.1空载体转染人K562细胞。通过集落形成实验检测细胞增殖能力、FCM法分析细胞周期和细胞凋亡率,同时采用RT-PCR法检测基因JTV1及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、c-Myc转录水平的变化,Western blotting印迹法检测基因JTV1及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、c-Myc翻译水平。　　 结果:集落形成实验结果显示上调JTV1基因的表达后K562细胞的增殖能力明显降低;FCM法检测结果显示,与pcDNA3.1空载体转染组和未转染组的K562细胞相比,pcDNA3.1-JTV1转染组K562细胞的G期细胞比例升高;与空载体组和未转染组相比,pcDNA3.1-JTV1转染组Bax基因的mRNA转录水平和蛋白翻译水平均明显上升;而Bcl-2基因和c-Myc基因的mRNA转录水平和蛋白翻译水平则明显下调。　　 结论:JTV1基因过表达可能通过下调基因Bcl-2和c-Myc,而增强基因Bax的表达,从而抑制K562细胞的增殖并促进其凋亡。　　 第五部分通过Co-IP胞外验证与NLS-RARα作用的靶蛋白　　 目的:通过胞外实验验证谷氨酸氨连接酶(GLUL)与带有核定位信号的维甲酸受体α(NLS-RARa)之间的相互作用。　　 方法:将表达GLUL靶蛋白和NLS-RARot诱饵蛋白的两种质粒共同转化入AH109酵母菌,采用酵母双杂交技术验证它们在活细胞内的相互作用;通过构建GLUL和NLS-RARot蛋白标签融合表达载体,共转染至人胚肾HEK293细胞,利用免疫共沉淀技术在细胞外验证它们之间的相互作用。　　 结果:GLUL靶蛋白和NLS-RARα诱饵蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色的阳性克隆;GLUL蛋白及NLS-RARα标签融合表达载体构建成功,共同转染至HEK293细胞,采用抗HA多克隆抗体免疫沉淀HA-NLS-RARa相互作用蛋白复合物后,抗c-Myc单克隆抗体免疫印迹检测,检测到GLUL-cMyc蛋白。　　 结论:采用酵母双杂交和免疫共沉淀技术成功地在胞内外验证了GLUL和NLS-RARα之间存在特异性的相互作用。