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研究背景:SLE是一种典型的自身免疫性疾病,存在多种免疫异常,包括T、B淋巴细胞的异常活化增殖,自身反应性抗体的大量产生,免疫复合物的形成及沉积,造成组织器官,特别是肾实质的免疫损伤,引起肾小球肾炎,甚至肾功能衰竭。
学者们普遍认为人和小鼠狼疮发病过程中T细胞异常活化增殖起关键作用,抑制T细胞的活化和增殖对SLE治疗有重要意义。Akt/GSK3β途径是影响细胞增殖活化的一条重要通路,Akt在T淋巴细胞活化增殖过程中作为增殖及生存信号的重要介质,其磷酸化可调控细胞周期进程促进T细胞增殖。越来越多的证据显示Akt的异常磷酸化可通过促进细胞增殖参与疾病的发生发展,研究表明SLE小鼠T细胞中Akt的磷酸化水平增高。磷酸化的Akt主要通过对含有丝氨酸/苏氨酸残基的底物磷酸化而发挥作用,目前,已确认的Akt下游底物包括GSK3β、p21WAFI/CIPI、mTOR等,其中,GSK3β是Akt的重要底物之一,缺乏生长因子等刺激时GSK3B可使p27kipl磷酸化,增强其稳定性,阻止细胞周期进程。与Akt相反,静息细胞中GSK3p处于活化状态,细胞活化时其磷酸化而失活,文献报道T细胞活化早期GSK3β迅速灭活,通过诱导NFAT(活化T细胞核因子)活化和IL-2产生调节TCR介导的T细胞增殖。尽管既往研究证实调节.Akt上游分子P13K活性可改善SLE病情,而且提示P13K/Akt信号通路的改变可能对SLE发病有影响,但关于人类SLE患者Akt在T细胞增殖中的表达,特别是Akt的表达与狼疮肾炎的关系国内外相关报道较少,且其对下游蛋白分子GSK3β的影响仍不清楚,需要进一步证实这一途径在人类SLE发生发展中的作用。
目前由于发病机制未明,SLE尚缺乏理想的治疗方法,寻求相对创伤小、简便、安全、易于临床应用的治疗方法已成为目前国内外研究的热点。
骨髓间充质干细胞(BM-MSC)是骨髓中除了造血干细胞以外的另一类干细胞,具有诱导免疫耐受和免疫抑制、促进免疫重建的作用。通常抗原刺激可引起T细胞分裂,BM-MSC可通过抑制细胞分裂而使细胞积聚在G1期。体外研究发现MSC能抑制包括同种异体抗原和丝裂原引起的T细胞增殖。
本实验首先观察了SLE患者T细胞增殖中.Akt/GSK3β通路的活化状态,并在此基础上探讨SLE患者T细胞增殖时Akt/GSK3β信号通路在骨髓间充质干细胞干预中的变化。
第一部分SLE患者T细胞增殖中Akt/GSK313信号通路的异常表达
目的:通过观察SLE患者特别是狼疮肾炎患者T细胞增殖过程中Akt/GSK3β信号通路的表达情况,了解Akt/GSK3β信号通路在SLE患者T细胞异常增殖过程中所起的作用。
方法:
1、研究对象:实验中SLE患者均符合1997年修订的美国风湿学会SLE诊断标准,疾病活动评分标准采SLEDAI。根据是否有肾损害分为肾损害组(RSLE组)和非肾损害组(SLE组)。选择性别、年龄与患者组相匹配的健康志愿者作为对照。
2、外周血单个核细胞(主要是T细胞)的分离和培养:采用人Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液的密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC,大部分是T细胞),用植物血凝素(PHA)刺激。
3、流式细胞仪检测细胞周期。
4、用western blot检测细胞蛋白表达。
5、MTT法检测细胞活性。
结果:
1、患者淋巴细胞在不同细胞周期的分布:未用PHA刺激时肾损害组和非肾损害组患者淋巴细胞在不同细胞周期时相的分布与对照组相比无明显差异,用PHA刺激48小时后,肾损害组和非肾损害组患者淋巴细胞S期比例与对照组相比显著增高,而刺激后两组患者淋巴细胞G0/G1比例与对照组相比显著降低,以肾损害组最明显,G2/M比例三组淋巴细胞之间无差异。
2、患者T细胞增殖中CDK2、p21WAF1/CIP1和p27kiP1的表达:静息状态下,肾损害组和非肾损害组淋巴细胞中CDK2仅轻度表达,PHA刺激后,三组淋巴细胞CDK2表达均增强,且在肾损害组改变最显著;相反,在肾损害组和非肾损害组未刺激淋巴细胞与对照组相比p27kiPl和p21WAF1/CIP1表达轻度降低,PHA刺激后三组淋巴细胞p27kip1和p21WAF1/CIP1表达均进一步下调,肾损害组改变最明显。
3、患者T细胞增殖中Akt及GSK3β磷酸化水平:与对照组相比,肾损害和非肾损害组未刺激淋巴细胞Akt和GSK3β的磷酸化水平轻度增高,PHA刺激可增高各组淋巴细胞Akt和GSK3β的磷酸化水平,肾损害组表现最明显,但各组刺激前后总Akt和GSK3β水平无明显改变。
4、GSK3β抑制剂对患者淋巴细胞增殖的影响:GSK3β抑制剂氯化锂或SB216763处理淋巴细胞后,肾损害组淋巴细胞增殖程度分别增加51.5%和42.6%,而非肾损害组则分别增加33.5%和30.3%,对照组淋巴细胞用氯化锂或SB216763刺激后其增殖程度分别增加24.2%和20.5%,肾损害组淋巴细胞增加最显著。
结论:
1、SLE患者T细胞增殖过程中Akt、GSK3p磷酸化水平明显增高,说明Akt/GSK3B信号通路存在异常。
2、SLE患者T细胞增殖过程中细胞周期调控蛋白表达改变从而影响细胞周期进程。
第二部分SLE患者T细胞增殖中Akt/GSK3β信号通路在骨髓间充质干细胞干预中的变化
目的:通过观察BM-MSC对SLE患者T细胞增殖的影响及SLE患者T细胞增殖过程中AkVGSK3β信号通路在BM-MSC干预时的变化,探讨AkVGSK3β调控通路在BM-MSC抑制SLE患者T细胞增殖中的作用。
方法:
1、骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定:采用羟基淀粉沉淀联合Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,贴壁法进行原代细胞培养,胰酶消化法传代接种培养,流式细胞术检测BM-MSC表面标志表达。
2、按说明书用自动化磁性细胞分选仪分选CD3+T淋巴细胞
3、体外BM-MSC对T细胞增殖的影响
按以下分组:(1)阴性对照组:单独淋巴细胞培养组;(2)阳性对照组:淋巴细胞加PHA培养组;(3)实验组:淋巴细胞加PHA及BM-MSC细胞培养,MTT法检测BM-MSC作用后淋巴细胞的相对活细胞数(吸光度A值)及计算细胞存活率。
4、研究对象、外周血单个核细胞的分离和培养、蛋白表达的检测同前。
结果:
1、BM-MSC对正常人T细胞增殖的影响:BM-MSC作用于PHA刺激的正常人CD3+T细胞,发现其吸光度与单纯PHA刺激组相比明显降低,T细胞增殖被明显抑制(与PHA刺激组比较,细胞增殖下降55.55%)。
2、BM-MSC对正常人T细胞CDK2、p21TMF1/CIP1和p27kip1表达的影响:BM-MSC加PHA刺激组CDK2表达被抑制,p21TMF1/CIP1和p27kip1明显上调,而单纯PHA刺激组T细胞CDK2表达增加,p21TMF1/CIP1、p27kip1下调。
3、BM-MSC对正常人T细胞Akt及6SKap磷酸化水平的影响:PHA刺激后Akt磷酸化水平显著上升,加入BM+MSC则使PHA刺激上升的Akt磷酸化水平下降;PHA束U激后GSK313磷酸化水平明显增高,GSK313失活,加入BM-MSC后较PHA刺激组GSK3β磷酸化水平下降,但各组刺激前后总Akt和GSK3β水平无明显改变。
4、正常人BM-MSC对SLE患者T细胞增殖的影响:BM-MSC加入PHA刺激的SLE患者PBMC细胞,发现其吸光度明显低于PHA刺激组,T细胞增殖被抑制(与PHA束U激组比较,细胞增殖下降57.23%)。
5、BM-MSC对SLE,患者T细胞CDK2、p27kip1和p21WAF1CIP1表达的影响:PHA刺激后,患者淋巴细胞CDK2表达较强而p21WAF1CIP1、p27kip1则明显减低,加入BM-MSC干预则抑制CDK2的表达而强烈表达p21WAF1CIP1和p27kip1。
6、BM-MSC对SLE患者T细胞Akt及GSK3β磷酸化水平的影响:PHA刺激SLE患者PBMC后Akt磷酸化水平上升,而BM-MSC干预则引起Akt磷酸化水平下降;PHA刺激使细胞GSK3β磷酸化水平明显增高,与BM-MSC共培养则其磷酸化水平较PHA刺激组下降,但各组刺激前后总Akt和GSK3β水平无明显改变。
结论:
1、 BM-MSC干预SLE患者T细胞增殖,使其Akt、GSK3β磷酸化水平降低,说明BM-MSC对SLE患者T细胞增殖过程中异常Akt/GSK3β信号通路有一定的调节作用,为BM-MSC治疗SLE提供了新的理论依据
2、BM-MSC可调节SLE患者T细胞增殖过程中细胞周期调控蛋白的表达,抑制SLE患者T细胞增殖。