急性心肌梗死后,因大量心肌细胞坏死不能再生,可引发左室重构及扩大,最终导致心力衰竭,严重危害人民生命。目前冠脉再通治疗(包括急诊溶栓和介入),虽能挽救缺血心肌,但仍不能挽救坏死心肌。心肌梗死后,局部心肌组织缺血、缺氧,导致心肌细胞大量坏死和凋亡,坏死心肌被纤维组织代替,引起心室重构、变薄,左室舒张末压力增高,心室扩大,最终因心功能恶化发展为心力衰竭而告终。干细胞是一类未分化,能无限或较长期增殖、自我更新,并且在适当条件下能分化为多种功能细胞或组织器官的原始细胞。研究表明:将干细胞植入损伤心肌后,能增加心肌细胞的数量,增加心肌血管供给,改善受损心肌的收缩功能。可分化为心肌和血管内皮细胞,是心血管再生医学的理想新细胞,且证实了MSCs治疗AMI的有效性和可行性。目前认为MSCs移植治疗心肌梗塞的机制主要有以下几个方面:(1)分化为具有收缩功能的心肌样细胞,表达心肌特异性收缩蛋白,与正常心肌细胞形成闰盘连接,参与宿主心肌同步收缩,缩小瘢痕面积。(2)分化为血管内皮细胞或通过旁分泌机制分泌各种细胞因子。细胞因子主要有两类:即促血管生成因子和炎症因子。(3)增加心脏粘蛋白的表达和神经的生长以及心房交感神经的过度分布。(4)通过调节细胞外基质,缓解梗死壁变薄和左室腔扩大,提高局部室壁运动,改善心室重塑。研究表明:独参汤可保护内皮功能,缩小AMI冠脉再通后无复流面积,改善心肌组织再灌注,改善心脏功能,抗凋亡,促进血管新生等效用。中药联合MSCs能提高MSCs在梗死后心肌中的存活和分化,并显著改善心功能和减少灌注缺损面积,可能是中药独参汤改良“土壤”(损伤的心肌为环境),有利于“种子”(移植干细胞)的存在、分化和发挥效用。改善心功能、修复受损的心肌细胞,减轻心室重塑。目的:1骨髓间充质干细胞的体外分离、扩增、培养。2采用结扎大鼠冠状动脉前降支(LAD)方法,建立大鼠急性心肌梗死模型。3明确骨髓间充质干细胞(MSCs)联合独参汤经心肌直接注射法移植可改善心功能,预防和治疗心室重构。4观察MSCs联合独参汤对大鼠急性心肌梗死后细胞凋亡及凋亡相关蛋白caspase-3表达的影响。方法:1骨髓间充质干细胞的体外分离、扩增、培养;取Wistar雄性大鼠,采用贴壁筛选法与密度梯度离心相结合的方法分离纯化。每次取Wistar雄性大鼠1只,断颈处死,浸于体积分数为75%乙醇10min,无菌条件下取出股骨和胫骨,以无菌PBS平衡盐缓冲液反复冲洗骨髓腔。收集骨髓液于预先加入DMEM培养基的50mL无菌离心管,以2000r/min转速离心20min,吸取单个细胞层(低密度细胞,位于两层液体的分层处)。DMEM培养基漂洗细胞两次,1000r/min转速离心5min,弃上清,取细胞沉淀。细胞沉淀中加入含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基,调整细胞密度约1×10~6/mL,接种于25cm2细胞培养瓶。48h后更换培养基,去除未贴壁细胞,以后每3d换液1次。原代细胞80%左右融合时予以传代,弃除旧培养基,以无菌PBS平衡盐缓冲液漂洗3次, 1000r/min转速离心10min。弃上清,取细胞沉淀,加入含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基,按1:2比例传代。体外扩增MSCs,传代至第5代,以PBS平衡盐缓冲液制备单细胞悬液,予流式细胞学检测细胞表面标志。2采用Olivette方法结扎左冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型。动物麻醉:大鼠称重后,用10%水合氯醛行腹腔内注射麻醉(35mg/kg),待动物充分麻醉后行气管插管,连接小动物呼吸机,行正压辅助呼吸。消毒后切开皮肤,钝性分离胸大肌,开胸,充分暴露心脏,用眼科缝合线距左心耳下缘约1-2cm处,选择前降支成功结扎后,心梗区心肌颜色变暗,心电图可见相应导联ST- T段抬高或压低,逐层关胸,术后做好实验动物的保温,常规应用青霉素20万U每天,连续应用至少三天,在术区完全愈合前,单独饲养。3动物分组:将Wistar大鼠40只随机分为4组:I组急性心肌梗死对照组(AMI, n=10):大鼠心肌梗死后注射等量培养基;II组急性心肌梗死+干细胞移植组(AMI+ BMSCs, n=10):急性心肌梗死大鼠接受同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗(2×10~6 BMSCs /100 u1,分4点注入);III组急性心肌梗死+独参汤组(AMI+独参汤, n=10):大鼠急性心肌梗死后2小时开始灌服独参汤,每日二次,共用一周;IV组急性心肌梗死+干细胞移植组+独参汤组(AMI+BMSCs+独参汤, n=10):大鼠急性心肌梗死后接受同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗(2×10~6BMSCs /100 u1,分4点注入),2小时后开始灌服独参汤,每日二次,共用一周。4心功能检测:在骨髓间充质干细胞移植后4周,进行大鼠心脏超声检查。测量左心室舒张末内径(LVDd),左心室收缩末内径(LVDs)并计算心输出量(CO)和缩短分数(FS)。5心脏标本处理:在骨髓间充质干细胞移植后4周后,行心脏超声检查后,断颈处死大鼠,将心脏标本切成厚度约3mm切片,行石蜡包埋,行心脏HE染色。6心肌细胞凋亡的检测:采用TUNEL法原位标记凋亡细胞。细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量粘性3’-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-OH末端,从而进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(Terminal deoxyribonucleic transferase mediated d-UTP nick end labeling,TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够染色。具体方法按说明书操作。7 Caspase- 3活性检测:caspase-3的前体被激活后表现出其活性,DEVD-pNA可以作为底物被caspase-3酶解,生成可吸收400-405nm波长的产物,根据产物吸光度的高低可推断其相对活性。结果:1骨髓间充质干细胞培养结果:①原代细胞接种2d后多数细胞贴壁,传代后细胞贴壁速度和增殖更快,第5代基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈放射状或漩涡状排列。②第5代骨髓间充质干细胞CD44阳性细胞占92.4%,CD90阳性细胞占88.9%,CD34阴性细胞占96.6%,CD45阴性细胞占95.6%。2心脏超声:四组术后各项参数(CO, FS)与术前相比均有显著差异(P<0.05 ),心输出量(cardiac output,CO)和缩短分数(fractional shortening,FS)均有明显降低,而术前各项参数组间比较无显著差异。II、III、IV组术后各项参数较I组比较均有提高;其中II组和IV组各项参数明显高于I组,且具有显著性差异(P<0.05 ),而又以IV组对心肌梗死后的心脏泵血功能改善为最佳。3组织病理学结果:术后4周的大鼠心脏标本HE染色可见广泛心肌纤维化,心肌组织排列紊乱,伴有邻近心肌纤维萎缩(或)肥大,心肌组织之间夹杂有大量疤痕组织,并可见轻度的淋巴细胞为主的炎症细胞浸润,脂肪样改变;细胞移植组心脏标本HE染色示心肌组织间也有结缔组织增生,没有发现血管瘤,小血管数量较为丰富。4 TUNEL检测结果:凋亡细胞表现为细胞核呈棕黄色着染,正常非凋亡细胞心肌细胞未见或偶见TUNEL阳性细胞,被苏木素复染呈蓝色,核相对较大,形态大小较为一致。心肌梗死对照I组,凋亡指数最高,明显高于II、III、IV组,差异具有显著性(P<0.01);组IV凋亡指数最低且与组II、III比差异具有显著性(P<0.01);组II组III,组间比较差异无显著性(P>0.05)。5 Caspase-3活性结果:各组间caspase-3活性变化caspase-3活性测定显示,组IV心肌细胞caspase-3活性水平低,组I活性最高(P<0.01),组II、III、IV经处理后可明显抑制其活性增高,组IV抑制效果优于组II、III。结论:1采用结扎大鼠冠状动脉前降支(LAD)方法,建立大鼠急性心肌梗死模型,造模成功率较高,重复性好,有较强的实用性。2骨髓间充质干细胞心肌注射联合独参汤可改善大鼠急性心肌梗死后心功能。3骨髓间充质干细胞能改善梗死区的供血、供氧,抑制caspase-3蛋白分子在心肌细胞的表达,从而减轻心肌细胞的凋亡,改善心功能;骨髓间充质干细胞心肌注射联合独参汤效果更加明显,表明中药独参汤可能促进骨髓间充质干细胞分化、增殖。