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白念珠菌是常见的条件致病性真菌之一,自然界中以二倍体形式存在。由于钙信号转导途径在真菌应对环境胁迫中的重要作用,近年来对它的研究已成为热点。通过对2358个GRACE(Gene replacement and conditional expression)文库菌株的钙离子表型筛选,我们一共发现21个基因的缺失导致白念珠菌对高浓度的胞外钙离子敏感。这些基因的功能除了参与钙离子/钙调磷酸酯酶信号转导途径外,还与三羧酸循环、细胞壁完整性途径、细胞分裂和细胞内pH稳态相关。这些基因中的9个基因的失活导致的钙离子敏感性可以部分或完全被钙调磷酸酯酶抑制剂(环孢菌素A)所抑制。因此,这21个基因中接近一半的基因失活菌株的钙离子敏感性是由于钙调磷酸酯酶信号途径的激活引起的。为了通过RNA测序方法进一步研究Crz1调控的钙离子激活基因,我们通过CRISPR(Clusters of regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9手段,在CRZ1基因起始密码子ATG下游引入两个TAA终止密码子,提前终止Crz1蛋白的表达,成功构建了crz1/crz1失活突变菌株。通过对野生型菌株和crz1/crz1失活突变菌株在钙离子处理条件下的全基因组规模RNA测序,我们发现钙离子胁迫条件下,219个基因的表达受Crz1正调控,59个基因的表达受Crz1负调控。Karababa等人以前通过DNA芯片方法找到的钙离子激活Crz1正调控的65个基因中,有40个基因存在于我们发现的219个基因中。对这40个重叠基因的启动子序列进行分析,我们发现一个新的Crz1结合位点[GGAGGC(A/G)(C/G)(A/T)G],它的序列与Karababa等以前发现的白念珠菌Crz1结合位点[G(C/T)GGT]明显不同,但是和以前报道的酿酒酵母Crz1结合位点[GNGGC(G/T)CA]很相似。凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)结果表明,白念珠菌Crz1蛋白在体外均能专一性结合Crz1目标基因之一UTR2启动子上的两个Crz1结合位点,5’-G(-376)GGCT-3’和5’-T(-333)GAGGCGTTG-3’。染色质免疫共沉淀(ChIP)分析证实白念珠菌Crz1蛋白在体内可以结合包含这两个位点的UTR2启动子序列。前人研究发现白念珠菌中与细胞周期调控相关的蛋白激酶Hsl1,与我们实验室最近发现的细胞质膜上钙离子摄入的负调控因子Rch1蛋白一样,存在于白念珠菌的芽颈部位。有趣的是,我们的GRACE文库筛选结果表明HSL1基因与白念珠菌的钙离子敏感性相关。所以,本研究构建了hsl1/hsl1失活突变菌株,发现hsl1/hsl1失活突变株除了对钙离子敏感外,还对其他导致细胞壁和细胞膜胁迫的药物敏感。本论文的所有结果为我们深入和全面了解白念珠菌细胞内钙离子稳态的调控机理奠定了基础,同时为发现新的抗真菌药物靶标提供了重要线索。