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目的:流体剪切力(FSS)联合材料表面化学官能团共同刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs),观察不同材料表面上HUVECs对梯度FSS的应答情况,探讨材料化学对细胞响应剪切力刺激的作用。
方法:通过自组装单分子层技术在玻片表面分别制备末端基团为-OH、-CH3和-NH2的自组装单分子层,空白Glass玻片作为对照,通过检测材料表面水接触角对材料进行表征。将HUVECs分别接种于Glass、-OH、-NH2和-CH3组玻片表面,培养15分钟内检测ATP的释放量,1小时检测NO的释放量,1小时后Western blotting对内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达进行测定,48小时后在激光共聚焦显微镜下观察HUVECs中黏着斑及细胞骨架的形成,BCA法测定总蛋白量。根据已有的平行板流动腔搭建剪切力刺激平台,将HUVECs分别接种于4组玻片表面,当细胞融合至80%时分别加载5dyn/cm2、15dyn/cm2、20dyn/cm2FSS1小时,加载剪切力15分钟内检测ATP的释放量;1小时检测NO的释放量。加载剪切力1小时后Western blotting检测eNOS的表达,BCA法测定总蛋白量。
结果:通过水接触角的检测证明自组装单分子层技术成功制备了表面分别具有亲/疏水性适中的-NH2、强亲水性-OH和强疏水性-CH3化学官能团的材料。将HUVECs接种在Glass以及具有不同末端基团的玻片上,单纯材料表面化学刺激下各组内皮细胞各项应答无明显差异。与内皮细胞在Glass表面上细胞骨架和黏着斑对比:-NH2亲水性和疏水性适中,内皮细胞在-NH2玻片上形成了黏附质量最佳的细胞骨架和黏着斑;-OH基团具有强亲水性,-CH3基团具有强疏水性,均不利于细胞黏附,-OH和-CH3玻片上形成了黏附质量相对较差的细胞骨架和黏着斑。在已有的平行板流动腔装置的基础上成功搭建了剪切力刺激平台。加载梯度FSS于材料表面化学共同刺激内皮细胞后发现,LFSS(5dyn/cm2)没有引起Glass和-NH2上的内皮细胞产生应答,但是低剪切力引起了-OH和-CH3的强烈应答;PFSS(15dyn/cm2)和HFSS(20dyn/cm2)引起了所有组细胞的应答,其中-NH2组的应答水平最强烈,其次为Glass组,-OH与-CH3组应答水平相当且处于最低状态。-OH和-CH3组在FSS梯度刺激时,LFSS时应答最强烈,其次PFSS,最弱为HFSS。
结论:材料表面化学官能团通过影响HUVECs在材料表面形成的黏着斑和细胞骨架的质量,改变了HUVECs响应FSS刺激的起始阈值和使细胞产生最佳应答的剪切力阈值,从而使内皮细胞对剪切力刺激的应答状态发生改变。HUVECs上黏着斑和细胞骨架可能是材料表面化学刺激与物理剪切力刺激的共同作用位点。
方法:通过自组装单分子层技术在玻片表面分别制备末端基团为-OH、-CH3和-NH2的自组装单分子层,空白Glass玻片作为对照,通过检测材料表面水接触角对材料进行表征。将HUVECs分别接种于Glass、-OH、-NH2和-CH3组玻片表面,培养15分钟内检测ATP的释放量,1小时检测NO的释放量,1小时后Western blotting对内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达进行测定,48小时后在激光共聚焦显微镜下观察HUVECs中黏着斑及细胞骨架的形成,BCA法测定总蛋白量。根据已有的平行板流动腔搭建剪切力刺激平台,将HUVECs分别接种于4组玻片表面,当细胞融合至80%时分别加载5dyn/cm2、15dyn/cm2、20dyn/cm2FSS1小时,加载剪切力15分钟内检测ATP的释放量;1小时检测NO的释放量。加载剪切力1小时后Western blotting检测eNOS的表达,BCA法测定总蛋白量。
结果:通过水接触角的检测证明自组装单分子层技术成功制备了表面分别具有亲/疏水性适中的-NH2、强亲水性-OH和强疏水性-CH3化学官能团的材料。将HUVECs接种在Glass以及具有不同末端基团的玻片上,单纯材料表面化学刺激下各组内皮细胞各项应答无明显差异。与内皮细胞在Glass表面上细胞骨架和黏着斑对比:-NH2亲水性和疏水性适中,内皮细胞在-NH2玻片上形成了黏附质量最佳的细胞骨架和黏着斑;-OH基团具有强亲水性,-CH3基团具有强疏水性,均不利于细胞黏附,-OH和-CH3玻片上形成了黏附质量相对较差的细胞骨架和黏着斑。在已有的平行板流动腔装置的基础上成功搭建了剪切力刺激平台。加载梯度FSS于材料表面化学共同刺激内皮细胞后发现,LFSS(5dyn/cm2)没有引起Glass和-NH2上的内皮细胞产生应答,但是低剪切力引起了-OH和-CH3的强烈应答;PFSS(15dyn/cm2)和HFSS(20dyn/cm2)引起了所有组细胞的应答,其中-NH2组的应答水平最强烈,其次为Glass组,-OH与-CH3组应答水平相当且处于最低状态。-OH和-CH3组在FSS梯度刺激时,LFSS时应答最强烈,其次PFSS,最弱为HFSS。
结论:材料表面化学官能团通过影响HUVECs在材料表面形成的黏着斑和细胞骨架的质量,改变了HUVECs响应FSS刺激的起始阈值和使细胞产生最佳应答的剪切力阈值,从而使内皮细胞对剪切力刺激的应答状态发生改变。HUVECs上黏着斑和细胞骨架可能是材料表面化学刺激与物理剪切力刺激的共同作用位点。