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目的与意义组织纤维化和严重的瘢痕形成是创伤愈合过程经常发生的不良事件,如果是发生在主要脏器会危及生命,大面积发生在体表会影响皮肤正常生理功能的发挥,而发生在颜面部位则会严重影响患者的自信。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是TGF-β超家族主要成员之一,在组织纤维化和瘢痕形成方面扮演重要角色,阻断TGF-β1活化的TGF-β/Smad信号通路在预防或治疗组织纤维化和瘢痕形成方面具有重要的临床价值。TGF-β受体(transforming growth factor-βreceptor,TβR)为丝氨酸/苏氨酸激酶受体家族成员,为单次跨膜蛋白,存在TβRI、TβRⅡ和TβRⅡI等三种亚型,其中TβRI和TβRⅡ参与了TGF-β1信号通路的激活。TGF-β1首先与TβRⅡ结合并导致后者胞内域磷酸化,招募TβRI形成异源二聚体,随后激活Smad信号通路并最终导致成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,大量分泌I型和ⅡI型胶原蛋白,从而导致组织纤维化和瘢痕形成。因此,采用抗体药物阻断TGF-β1与TβRⅡ的结合反应即可能有效阻断TGF-β1/Smad信号通路,并有效阻断组织纤维化和瘢痕形成。纳米抗体(Nanobody,Nb)亦称单域抗体(single domain antibody,sd Ab)或重链单域抗体(variable domain of the heavy chain of heavy-chain antibody,VHH),是一类以羊驼单链重链抗体可变区构建的新型小分子抗体,高4.8nm,直径2.2nm,大小约为15 KDa,具有良好的理化稳定性和组织穿透能力,并且可以利用微生物基因工程系统高效、廉价生产,因此在治疗性抗体研发中具有广阔的应用前景。筛选靶向与配体TGF-β1结合的位于TGF-βⅡ型受体界面区的纳米抗体或许有可能降低或阻断TGF-β1所传递的信号,甚至成为抑制瘢痕形成的有效策略。纳米抗体分子量小,稳定性高,利用微生物系统就能实现高效制备,因此在药物研发中具有很好的应用前景。本研究拟从人源化纳米抗体噬菌体展示库筛选一种靶向TβRⅡ配体结合区的纳米抗体,建立高效制备方法,并对其体外生物学活性进行初步研究,为进一步研发抗纤维化和瘢痕形成的纳米抗体药物打下坚实基础。研究内容与方法1、抗原肽设计与合成采用CN3D4.1软件分析TGF-β1与TβRⅡ结合的3D结构模型,找到二者相互作用界面区,选取随机卷曲的肽段为抗原肽,采用化学合成法合成。2、抗TβRⅡ纳米抗体的噬菌体展示与筛选抗原肽包被于氨基化酶标板中,利用商品来源人源化纳米抗体噬菌体展示库(库容量为3×109)进行三轮淘洗,ELISA法鉴定阳性克隆,测序后进行DNA序列分析鉴定。3、纳米抗体的重组工程菌构建与小规模制备按大肠杆菌偏爱密码子设计纳米抗体目的基因,3’端引入His6标签序列,按常规方法克隆于p ET21b表达载体的NdeⅠ和HindⅢ位点之间,热击法导入表达宿主大肠杆菌shuffle T7B中,以便目的基因在T7启动子驱动下高效表达。SDS-PAGE法分析纳米抗体抗体表达情况,Western blot法鉴定表达产物,选取高效表达克隆作为工程菌保存备用。摇瓶规模发酵培养,IPTG诱导菌体经超声破碎后电泳分析上清和沉淀中的目的表达产物分布情况,以确定目的蛋白表达产物以可溶蛋白还是包涵体蛋白形式存在。根据目的蛋白的理化特性,利用阳离子交换(CM-Sepharose FF column)和镍离子螯合层析柱(Ni-NTA column)二步法纯化目的蛋白,以分子筛层析(Sephadex G25 colum)置换缓冲液,BCA法检测目的蛋白浓度。4、纳米抗体与成纤维细胞表面受体的特异性结合以成纤维细胞NIH3T3为靶细胞,在6孔板中每孔接种5×104个细胞,采用含10%胎牛血清的DEME培养基培养24h,接着无血清培养24 h,用5%BSA溶液封闭,加入不同浓度TβRⅡ纳米抗体共孵育,以FITC标记的鼠抗His6抗体检测纳米抗体,采用荧光显微镜观察细胞表面特异性结合的纳米抗体。5、纳米抗体对成纤维细胞增殖的抑制效应主要通过观察对靶细胞的生长抑制效应来考察纳米抗体对TGF-β1刺激信号的阻断效应。以成纤维细胞NIH-3T3为靶细胞,用含10%胎牛血清的DEME培养基培养后血清饥饿24 h,加入TGF-β1和不同浓度TβRⅡ纳米抗体共孵育48 h,按常规MTT法检测细胞生长抑制率。6、纳米抗体对成纤维细胞胶原蛋白表达的影响通过观察对成纤维细胞的I型和ⅡI型胶原蛋白表达的影响来考察纳米抗体对TGF-β1的阻断效应和抗纤维化与瘢痕形成的潜力。成纤维细胞NIH-3T3用TGF-β1和不同浓度TβRⅡ纳米抗体共孵育后进行Western blot法分析,用抗Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的单克隆抗体为一抗。7、纳米抗体对成纤维细胞迁移能力的影响以细胞划痕法体外模拟创面愈合的过程,观察纳米抗体对成纤维细胞迁移能力的影响及对TGF-β1的阻断效应。结果1、抗原肽设计与噬菌体纳米抗体筛选从TβRⅡ的配体结合界面区选取一段由15氨基酸残基组成的随机蜷曲多肽为抗原肽。经噬菌体展示和三轮淘洗得到32株阳性克隆,经DNA序列分析鉴定均为2个不同的纳米抗体,分别命名为TβRⅡNb17和TβRⅡNb21。2、纳米抗体工程菌的构建、表达与纯化以p ET21b为表达载体和E.coli Shuffle T7-B为表达宿主菌成功构建了TβRⅡNb17和TβRⅡNb21高效表达工程菌,且二种纳米抗体均以可溶性表达产物存在。表达产物经阳离子交换和镍离子螯合层析柱二步纯化后纯度达到98%以上。3、纳米抗体与成纤维细胞表面受体的特异性结合TβRⅡNb17和TβRⅡNb21二种纳米抗体均可特异性结合于成纤维细胞NIH3T3的表面,结合反应呈剂量依赖性。4、纳米抗体对成纤维细胞增殖活性的影响二种纳米抗体对成纤维细胞增殖的影响明显不同,TβRⅡNb17可抑制成纤维细胞的增殖、并抑制TGF-β1的刺激效应;TβRⅡNb21则可促进成纤维细胞的增殖,但不影响TGF-β1的刺激效应。5、纳米抗体对成纤维细胞胶原蛋白表达的影响TβRⅡNb17和TβRⅡNb21二种纳米抗体均可抑制成纤维细胞中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达,并能抑制TGF-β1的促胶原蛋白表达效应。6、纳米抗体对成纤维细胞迁移能力的影响二种纳米抗体对成纤维细胞迁移的影响明显不同,TβRⅡNb17可抑制成纤维细胞迁移、并抑制TGF-β1的刺激效应;TβRⅡNb21则可促进成纤维细胞的迁移,且对TGF-β1的刺激效应影响不大。结论:本研究基于配体和受体相互作用界面靶向策略成功获得了TβRⅡ配体结合位点的抗原肽,以此抗原肽从纳米抗体噬菌体展示库中成功筛选到2个人源化抗TβRⅡ纳米抗体,二者在大肠杆菌系统均可高效可溶表达,均可特异性结合于成纤维细胞表面的TβRⅡ,并由此阻断TGF-β1对细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达的刺激效应,但在对靶细胞增殖、迁移作用的影响出现了差异。本研究为研发用于防治纤维化和瘢痕增生的抗TβRⅡ纳米抗体打下了坚实基础。