花青苷是植物三大色素之一,属于黄酮类化合物,水溶性良好,能协助植物抵抗各种胁迫,另外,花青苷在人类保健及医疗领域也具有重要的应用价值。花青苷广泛存在于植物的各种组织中,在多个柑橘品种的特定组织中也有积累。因此,研究柑橘中花青苷的生物合成途径具有重要意义。花青苷负调控因子的挖掘工作在多种植物中已有成果,但目前为止,柑橘中的花青苷负调控因子尚无相关文献报道。本研究基于柑橘及其他植物中花青苷生物合成研究进展及本实验室已有的研究结果,对柑橘中花青苷生物合成负调控因子进行了挖掘及功能验证。具体研究结果如下:1.柑橘中存在一个R2R3-MYB转录因子MYB3,序列分析发现MYB3的C-末端具有一个C2-motif,进化树分析结果表明MYB3与已报道的VvMYBC2-L1、PhMYB27、FaMYB1、PtrMYB182及MtMYB2等转录抑制因子共同聚在一类,同属于FaMYB1类。对MYB3进行柑橘原生质体亚细胞定位实验,得出MYB3定位于细胞核,具有转录因子的普遍特性,转录活性实验结果表明MYB3具有转录抑制活性,因此得出MYB3是一个具有转录抑制活性的转录因子;2.利用实时荧光定量PCR对MYB3及转录正调控因子Ruby的表达量进行分析,结果显示MYB3与Ruby共表达,且与花青苷的积累呈正相关,在多种不同的柑橘品种中均存在该规律;3.将MYB3稳定表达于野生型拟南芥及Ruby超表达系拟南芥中,对MYB3及花青苷生物合成途径的结构基因进行实时荧光定量PCR分析其表达量,发现MYB3的表达量与结构基因的表达量呈反比,同时与花青苷含量呈反比,故推测MYB3能抑制抑制花青苷的生物合成,是结构基因表达降低所导致的;4.通过酵母双杂交、酵母单杂交、双分子荧光互补及烟草双荧光素酶瞬时表达实验验证得出,MYB3并非通过与Ruby竞争结合CsbHLH1也不直接结合在结构基因启动子上来发挥作用,而是通过抑制BMW复合体的活性来抑制花青苷的合成。