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降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是一种新型的内源性生物活性神经多肽,广泛分布于骨组织中。研究表明CGRP通过促进成骨细胞增殖、迁移和骨形成在骨折愈合中发挥关键作用,但其机制尚不明确。在内皮细胞中,CGRP可以通过提高VEGF、VEGF受体-2表达来增强内皮细胞的迁移,从而促进的血管形成。而据报道,在MG-63细胞中VEGF受体-2磷酸化升高可以明显提高MG-63细胞的存活率。VEGF-VEGFR系统在成骨细胞分化也发挥了重要作用。前期预实验显示,在MG-63细胞中,CGRP可以提高VEGF受体-2表达。因此,可以推测CGRP可能通过VEGFR调控骨折愈合。目的:构建VEGF受体-2干扰慢病毒载体,研究CGRP对VEGF受体-2干扰前后的MG-63增殖、迁移、VEGF受体-2表达及成骨标记collagenI表达,探讨VEGF受体-2在CGRP调控MG-63细胞增殖、迁移及骨形成相关蛋白表达变化中的作用。方法:1.将CGRP配成浓度分别为10-7、10-8、10-9、10-10mol/L的培养液,MG-63细胞在上述CGRP培养液下作用5天后,采用Western bloting检测细胞中VEGF受体-2蛋白表达情况。初步探索CGRP对MG-63细胞VEGF受体-2表达的影响,并为后续实验选取合适的CGRP浓度提供基础。2.摘取文献报道的VEGF受体-2干扰siRNA序列,利用Western bloting验证干扰效果,将它构建到慢病毒载体中,通过PCR鉴定阳性克隆,并通过测序鉴定筛选出的阳性克隆。在293T细胞中进行病毒包装,纯化、滴度测定。3.将MG-63细胞接种到96孔板中,按MOI=30、60、100进行慢病毒感染预实验。4.将VEGFR-2干扰后的MG-63细胞接种到6孔板,并在CGRP10-7mol/L下培养,利用Western bloting实验检测VEGFR-2蛋白表达。5.将VEGFR-2干扰后的MG-63细胞接种到96孔板,并在CGRP10-7mol/L下培养,利用MTT实验检测1、2、3、4天OD值。6.将VEGFR-2干扰后的MG-63细胞接种到24孔板,并在CGRP10-7mol/L下培养,进行Transwell实验,48h后进行穿膜细胞计数。7.将VEGFR-2干扰后的MG-63细胞接种到6孔板,并在CGRP10-7mol/L下培养,利用Western bloting检测collagenI的蛋白表达。结果:1.随着CGRP浓度的升高,MG-63细胞中VEGFR-2总蛋白的表达也提高。CGRP浓度在10-7mol/L时对VEGFR-2总蛋白的表达提高最明显。2.VEGFR-2干扰靶点的干扰效果有70%左右,说明干扰靶点有明显的干扰效果。3.通过PCR阳性克隆鉴定和测序证明构建的腺病毒表达质粒完全正确。通过试剂盒测定对照慢病毒滴度是6×108TU/mL,VEGFR-2干扰病毒的滴度是2×108TU/mL。4.荧光显微镜观察显示,VEGFR-2干扰慢病毒在MOI=100时感染MG-63细胞效果较好,感染效率可达90%,因此以MOI=100感染细胞进行后续试验。5. MG-63细胞、MG-63细胞+干扰对照病毒、MG-63细胞+VEGFR-2干扰病毒三组细胞经CGRP作用后VEGFR-2的相对表达量为1.30、1.23、0.53。MG-63+VEGFR-2干扰病毒组与MG-63细胞+干扰对照病毒组VEGFR-2的相对表达量相比明显降低,且差异明显(p<0.05)。6.随着培养时间的延长,MG-63+CGRP组与MG-63组细胞相比增殖速度加快,且有明显差异;MG-63+VEGFR-2干扰+CGRP组与MG-63+对照病毒+CGRP组细胞相比增殖速度降低,且有明显差异。7.MG-63+VEGFR-2干扰+CGRP组与MG-63+对照病毒+CGRP组相比侵袭能力明显降低,且差异非常显著(p<0.01),MG-63+CGRP组细胞与MG-63组细胞相比明显升高,且差异非常显著(p<0.01)。8.MG-63+VEGFR-2干扰+CGRP组与MG-63+对照病毒+CGRP组相比中collagenI蛋白的表达明显降低,且差异显著(p<0.05),MG-63+CGRP组细胞与MG-63组细胞中collagenI蛋白的表达相比明显升高,且差异非显著(p<0.05)。结论:CGRP能够提高MG-63细胞的增殖、迁移及软骨分化指标collagenI表达,VEGFR-2干扰后能够降低CGRP提高MG-63细胞的增殖、迁移及collagenI表达。因此,CGRP可能通过VEGFR-2调控MG-63细胞的增殖、迁移及collagenI表达。