骨髓炎(Osteomyelitis)是一种由骨感染引起的骨科疾病,骨感染可累及骨皮质、骨髓、骨膜以及周围软组织。从发病原因看,骨髓炎可继发于开放性骨折、内固定手术及关节置换术后感染的细菌污染,也可以如糖尿病患者因足部缺血,软组织坏死导致细菌从坏死部位侵入感染骨组织,而血源性骨髓炎多发生于儿童及老年人等免疫力低下的人群。能引起骨髓炎的致病菌很多,但目前最为常见的致病菌是革兰氏阳性金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌通过其粘附特性对骨组织进行感染,而骨细胞外基质富含蛋白质,如纤连蛋白、胶原蛋白和骨唾液酸蛋白,也为金黄色葡萄球菌的粘附提供了良好的生存环境。在感染过程中,形成的生物膜可以使细菌躲避机体免疫系统和抵抗抗生素的杀灭作用,同时病灶局部的血供差也使得药物对病原菌的清除变得极为困难。因此,时至今日对骨髓炎的治疗还依然是摆在骨科医生面前的一个难题。动物实验是目前研究骨髓炎发病机理、诊断和治疗的一个主要手段。设计出合理有针对性的动物模型对骨髓炎的研究是非常重要的。目前已知骨髓炎骨组织的病理变化主要表现为骨质破坏和骨缺损,已知这种骨性结构的病理改变与疾病引起骨重塑过程中成骨细胞与破骨细胞之间动态平衡的改变有关,尽管某些生物学活性因子如调节破骨细胞活性和功能的炎症因子已经被前人研究鉴定,金黄色葡萄球菌对骨重塑的影响机制及相关作用因子并不清楚。在骨髓炎的病理发生发展过程中,组织损伤往往伴随着骨细胞死亡,而骨细胞死亡是骨重塑过程中的重要环节。TLRs被认为是负责侦测侵袭微生物的固有免疫系统成分,其对于宿主识别微生物的生物学成分来说必不可少,尤其是对于革兰阳性菌的脂蛋白/脂肽类、肽聚糖和脂磷壁酸的识别。TNFR1的主要生理学功能是通过刺激B细胞来诱导抗体产生和急性炎症免疫反应。它与SpA相结合可激活NF-κB,促进能在抗原特异性免疫应答和炎症反应中起重要作用的IL-6的表达。本研究将详细探讨TLR2与TNFR1在骨骼感染金黄色葡萄球菌后相关因子的表达及信号通路的变化,以及二者之间的相互影响作用,以进一步明确骨髓炎发病机制及病理变化特点。目的研究在金黄色葡萄球菌感染的成骨细胞中tnfr1与tlr2之间的相互作用关系,及对金黄色葡萄球菌侵袭力的影响,为临床上治疗骨髓炎提供新的方法及潜在药物作用靶点。通过细菌缓释的方法,建立大鼠胫骨近端的骨髓炎模型,为研究骨髓炎提供可信、可靠的动物模型。局部注射jnk信号通路抑制剂(sp600125),观察骨髓炎的病理学改变,为下一步本研究应用于临床提供可靠的依据。方法通过annexinv-fitc/pi双染细胞凋亡检测试剂盒及流式细胞术检测细胞凋亡,通过定量逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)及免疫印迹(westernblotting)评估tlr2及凋亡相关蛋白及丝裂原活化蛋白激酶(mapks)信号通路蛋白表达水平,通过碱性磷酸酶试剂盒及茜素红染色检测碱性磷酸酶(alp)活性及钙盐沉积水平。通过沉默tnfr-1表达观察jnk信号通路及tlr2的改变,并且观察感染恢复的情况。采用细菌浓度为1x105cfu的金黄色葡萄球菌菌液与海藻酸钠及壳聚糖溶液用两步注射液滴法制成包裹金黄色葡萄球菌的壳聚糖-海藻酸钠复合微球,直径约1mm。术中在大鼠胫骨近端开钻一直径1mm骨孔,将细菌缓释微球置入大鼠骨髓腔中,进行细菌缓释诱导骨髓炎模型的形成。术后采用大体观察、分泌物培养及组织病理学等检查进行评价。将25μm的jnk信号通路抑制剂(sp600125)注射于大鼠骨髓炎感染的局部病灶中,he染色观察其病理学改变。结果1、金黄色葡萄球菌以时间依赖的方式诱导细胞凋亡,上调tlr2表达并激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路。抑制c-jun氨基末端激酶(jnk)信号通路可下调tlr2表达并抑制金黄色葡萄球菌诱导的促凋亡信号通路活化。短发夹rna介导的tlr2基因沉默可逆转金黄色葡萄球菌诱导的细胞凋亡、alp活性降低并钙质沉积减少,jnk信号通路的抑制具有相似的效应。随着感染的金黄色葡萄球菌浓度的增加,细胞的生存能力开始下降并出现死亡,表达tlr2,同时炎性因子(tnf-aandil-6)的分泌增加。c-jun氨基末端激酶(jnk)信号通路在金黄色葡萄球菌的感染过程中亦被激活。沉默tnfr1表达可以抑制金黄色葡萄球菌感染细胞中的jnk信号通路和降低tlr2蛋白水平,进而减少炎性因子(tnf-aandil-6)的分泌。沉默tnfr1同样可以减少感染了金黄色葡萄球菌细胞中的破骨细胞分化因子(RANKL)水平。2、造模过程中出现2例大鼠在术后1天内死亡,其余大鼠在术后均可见到术区伤口化脓,窦道形成,分泌物培养为金黄色葡萄球菌阳性,组织学检查证实为骨髓炎。经多方面评价证实了大鼠的骨髓炎模型建立成功(16例大鼠)。3、HE染色结果显示局部注射JNK通路抑制剂(SP600125)处理的大鼠,病灶处依旧存在病变组织,但与治疗前对比得到明显改善。结论TNFR1基因沉默可部分抑制金黄色葡萄球菌感染引起的TLR2表达增加,而TLR2阻断抗体可完全阻断金黄色葡萄球菌对TLR2表达的影响。TLR2阻断抗体抑制TNF-α和IL-6表达,但并不能降低至感染前水平,再一次说明在此过程中存在其它的信号通路作用。JNK通路的抑制剂可减少TNF-α、IL-6及TLR2表达,但也不能降低至感染前水平。总的来说,本部分研究中我们发现在金黄色葡萄球菌引起的细胞反应中,TLR2和TNFR1密切相关,并且对金黄色葡萄球菌感染有调节作用。细菌缓释方法能够有效模拟开放性骨折低毒性细菌持续感染局部骨组织,是建立大鼠胫骨骨髓炎一种有效、可靠的方法。成骨细胞凋亡和成骨分化依赖于JNK信号通路活化的程度,这为骨髓炎的治疗提供了新的潜在靶点,JNK信号通路的抑制剂对于大鼠骨髓炎的疗效是真实可靠的。