论文部分内容阅读
目的：利用先诱导后诱变的方法,筛选出具有高效分解多种尿毒素,并且能稳定遗传的乳酸菌,为慢性肾衰的肠道细菌疗法提供新菌种。方法：1.将原始保加利亚乳酸杆菌菌液置于尿毒症病人血清中反应24小时后,取上层血清测定其对肌酐基础降解能力。2.原始保加利亚乳酸杆菌株的定向诱导：将原始菌株接种于尿毒症病人血清中培养传代,每隔5代检测血清中肌酐浓度,直到出现能降解肌酐的菌株,为阳性菌株。3.最佳诱变剂的选定：测出原始保加利亚乳酸菌的生长曲线一>确定生长对数期一>确定紫外线及硫酸二乙酯的作用时间一>制备悬菌液一>紫外线诱变、硫酸二乙酯诱变、硫酸二乙酯-紫外线复合诱变处理一>稀释后涂布筛选平板培养一>挑取生长良好的菌株置入尿毒症病人血清中反应一>选择能使肌酐浓度下降幅度最大的菌株进行下一轮的诱变,依次类推进行三轮诱变一>经过三轮诱变后,选出降解肌酐强的菌株进行复筛并进行遗传稳定性研究一>确定能使菌株降解肌酐能力提高幅度最大的诱变剂。4.诱导后的保加利亚乳酸杆菌株的诱变：诱导后的阳性菌株制成菌悬液,运用最佳诱变剂进行三轮诱变,经过初筛和复筛,筛选出降解肌酐能力最强的菌株,并进行遗传稳定性研究。5.降解尿毒素的研究：诱导结合诱变选出的阳性菌制成菌悬液置于尿毒症病人血清中,以不含菌液尿毒症病人血清、原始菌株,诱导菌株,单独诱变选出的肌酐分解率最高的菌株为对照组,反应24小时后取上层血清测定其降解肌酐、尿素氮、尿酸、血磷、甲状旁腺素、同型半胱氨酸的情况。结果：1.原始保加利亚乳酸杆菌接种入尿毒症病人血清中,作用24小时后,作用前后肌酐的浓度没有明显变化(P>0.05)。2.原始保加利亚乳酸杆菌在尿毒症病人血清中传代20次后,稀释后在尿毒症病人血清反应24小时后,血清中肌酐浓度与空白对照组、原始菌株相比明显下降(P<0.05)。3.利用紫外线、硫酸二乙酯、硫酸二乙酯-紫外线三种诱变剂对原始保加利亚乳酸杆菌株进行三轮诱变处理,结果表明复合诱变效果最佳；最后筛选出DU3-12,肌酐分解率比原始菌株提高了9.86%的工程菌。4.经过诱导和诱变处理的保加利亚乳酸杆菌,通过初筛和复筛,筛选出对肌酐降解能力明显提高的菌株DUC3-17,其肌酐分解率达17.23%,比诱导后菌株提高了11.90%,比原始菌株提高了16.19%。5.在尿毒症病人血清中连续传代5次后,DU3-12、DUC3-17仍能显著地降低血清中肌酐的浓度,遗传稳定性较好。6.将菌悬液置于尿毒症病人血清中反应24小时后,与空白对照组比较,原始保加利亚乳酸杆菌组肌酐、尿素氮、尿酸、血磷、甲状旁腺素、同型半胱氨酸的浓度没有明显变化(P>0.05)；诱导菌株组肌酐、尿素氮、尿酸的浓度明显变化(P<0.05),血磷、甲状旁腺素、同型半胱氨酸浓度无明显变化(P>0.05)；DU3-12组肌酐、尿素氮、尿酸、血磷、甲状旁腺素的浓度明显下降(P<0.05),同型半胱氨酸的浓度无明显变化(P>0.05)；DUC3-17与所有对照组比较,肌酐、尿素氮、尿酸、血磷、甲状旁腺素的浓度有明显变化(P<0.05),与DU3-12相比,仅有同型半胱氨酸浓度无明显变化(P>0.05)。DUC3-17肌酐、尿素氮、尿酸、血磷、甲状旁腺素、同型半胱氨酸的分解率分别比是17.23%,36.02%,9.84%,15.73%,78.26%,12.69%。结论：1.原始保加利亚乳酸杆菌不具有降解肌酐、尿素氮、尿酸、血磷、甲状旁腺素、同型半胱氨酸的能力。2.原始保加利亚乳酸杆菌在尿毒症病人血清中培养传代,可获得降解肌酐,尿素氮,尿酸的能力,尿毒症病人血清可作为诱变前定向诱导剂。3.浓度1%硫酸二乙酯(DES)诱变处理20min,紫外灯(30W,距离30cm)照射15秒的复合诱变对乳酸菌降解肌酐能力影响效果最佳。4.运用尿毒症病人血清定向诱导后经DES-UV复合诱变的方法,成功获得能够高效分解多种尿毒素的保加利亚乳酸工程菌DUC3-17,能够稳定遗传。对肌酐、尿素氮、尿酸、血磷、甲状旁腺激素、同型半胱氨酸的降解能力比单独诱导或诱变的菌株强。