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实验一多层电纺PVA/P3HB4HB复合支架的制备及其生物相容性的研究目的:制备PVA/P3HB4HB多层电纺支架,通过体外实验探讨支架物理属性及其生物相容性。方法:取股骨头坏死或骨折延迟愈合患者的髂前上棘骨髓,离心分离h BMSCs培养。分别制备6%w/v的P3HB4HB、PVA溶液,电纺P3HB4HB支架、PVA支架及PVA/P3HB4HB多层支架(分别标记A、B、C组)。检测三组支架形貌和表征、接触角、拉伸力学性能。收集第4代h BMSCs接种于支架上,检测细胞粘附率、细胞增殖情况及吖啶橙荧光染色;细胞种植于支架上,分组分别行成骨、成软骨诱导培养,诱导培养第14 d采用茜素红、甲苯胺蓝染色验证支架上h BMSCs分化潜能。结果:扫描电镜观察三组支架成三维网状相互连通的结构,A、C组纤维直径较为均一,排列规整;纤维支架拉伸强度、拉伸弹性模量、最大力均是C组>A组>B组;细胞支架复合培养,1、3、6h细胞粘附率B组>C组>A组(P<0.05);CCK8检测,1、3、5、7天A组细胞增殖率均显著低于B、C组,1-4天B组细胞增殖幅度大于C组,4天后C组细胞增殖速度较B组快(P<0.05);细胞支架复合培养7天,吖啶橙荧光染色,支架上可见发绿色荧光的细胞,B、C细胞量较A组多;经过诱导培养,成骨和成软骨特异性染色C组均强于A、B两组。结论:多层电纺制备的PVA/P3HB4HB纤维支架具有良好生物相容性和有一定力学强度,有望成为理想的组织工程支架。实验二基于多层电纺的h BMSCs和PVA/P3HB4HB复合构建组织工程骨目的:采用多层电纺技术制备h BMSCs和PVA/P3HB4HB一次成形细胞-支架复合物,通过体内实验探讨细胞-支架复合物在裸鼠体内异位成骨能力。方法:取股骨头坏死或骨折延迟愈合患者的髂前上棘骨髓,离心分离h BMSCs培养。收集第4代h BMSCs细胞,采用流式细胞术鉴定细胞表面抗原。h BMSCs细胞悬液接种于爬片上,成骨诱导培养14天,通过茜素红染色、碱性磷酸酶染色、I型胶原免疫组化染色检测其成骨分化情况。配制6%w/v的PVA水溶液及6%w/vP3HB4HB溶液,实验组将细胞与材料共纺,一次成型细胞-支架复合物,对照组将细胞常规滴加于支架上。细胞-支架复合物体外培养1、7天后通过扫描电镜及DAPI荧光染色观察细胞在支架上的生长情况。两组均体外成骨诱导14天,植入裸鼠皮下,于植入后1、3、6月取出植入物行成骨相关染色。结果:流式细胞仪检测第4代h BMSCs高表达CD90、CD105、CD44、CD73表面抗原,不表达CD34、CD45表面抗原;经成骨诱导培养后,茜素红染色、碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫染色均呈阳性。扫描电镜见支架呈三维网状相互连通的结构,相互交错,纤维直径较为均一,细胞附着于纤维丝上生长,分泌细胞基质,培养7天镜下观察细胞量较第1天多,实验组多于对照组。DAPI染色显示细胞大量、均匀的种植在支架上。h BMSCs-PVA/P3HB4HB复合物植入裸鼠皮下,1、3、6个月实验组茜素红染色、Von Kossa染色、马松三色染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色检测均呈阳性,对照组呈弱阳性。结论:多层电纺PVA/P3HB4HB支架是适合细胞生长的、具有研发潜力的骨组织工程支架;多层电纺一次成型h BMSCs-PVA/P3HB4HB复合物,经体外成骨诱导后在裸鼠体内具有初步异位构建组织工程骨的能力。