第一部分三叉神经颈髓复合体S1PR1参与慢性偏头痛中枢敏化目的慢性偏头痛（chronic migraine,CM）是指患者连续三个月以上每月头痛至少发作15天,其中偏头痛样发作至少8天。CM治疗反应差、致失能性高,常给个人和社会带来严重的负担。慢性偏头痛病理生理机制的深入研究对于临床工作具有重要意义,其中中枢敏化被认为是慢性偏头痛的主要病理机制。近年来在多种疼痛模型研究中发现,鞘氨醇-1-磷酸受体1型（S1PR1）参与疼痛的发生及维持。然而,S1PR1是否参与慢性偏头痛中枢敏化的发展尚无研究。因此,本研究将在CM动物模型中探索三叉神经颈髓复合体（Trigeminocervical complex,TCC）中S1PR1的表达情况及对中枢敏化的影响。方法1.本研究采用反复腹腔注射（intraperitoneal injection,i.p）硝酸甘油（Nitroglycerin,NTG）的慢性偏头痛小鼠模型作为研究对象,即在第1,3,5,7,9天给予小鼠腹腔注射NTG（10mg/kg）。同时,给予相同剂量的生理盐水作为对照组（Saline组）。在每次给药前,检测小鼠眶周及后足足底的热痛及机械痛痛阈变化来反应模型构建情况。2.在模型构建完成后,我们首先通过免疫印迹法（Western blot,WB）和实时荧光定量聚合酶链式反应（q PCR）检测TCC部位S1PR1在m RNA和蛋白水平上的变化。接着使用免疫荧光染色技术观察TCC部位S1PR1蛋白表达变化及细胞定位。3.为进一步探索S1PR1在慢性偏头痛中枢敏化的作用,我们在小鼠腹腔注射NTG前给予S1PR1特异性抑制剂W146（1mg/kg,i.p）、功能性拮抗剂FTY720（0.01mg/kg,0.1mg/kg和1mg/kg,i.p）及S1PR1激动剂（SEW2871,20mg/kg,i.p）。在给药前以及硝酸给药后检测2小时小鼠眶周及后足足底痛阈变化。此外,我们还通过WB和免疫荧光技术分析了TCC部位降钙素基因相关肽（Calcitonin gene related peptide,CGRP）和c-fos表达变化。结果（一）在NTG模型中S1PR1在TCC部位的表达及定位情况1.反复NTG刺激诱导了小鼠眶周机械痛阈、后足足底机械痛阈及热痛阈明显下降。与Saline组相比,反复NTG给药后TCC部位S1PR1在m RNA（p＜0.01）和蛋白（p＜0.05）水平均表达上调。2.免疫荧光共染结果显示在TCC部位S1PR1可与小胶质细胞,星形胶质细胞以及神经元共定位,与Saline组相比,NTG组S1PR1阳性细胞数明显增加（p＜0.001）。（二）干预S1PR1后对反复NTG诱导的中枢敏化的影响1.行为学分析结果显示,与Saline组相比,给予小鼠腹腔注射S1PR1拮抗剂W146和FTY720可明显缓解反复NTG刺激诱导的眶周和后足足底痛觉敏化。然而在NTG给药前腹腔注射S1PR1激动剂并没有缓解小鼠痛觉敏化。2.CGRP作为慢性偏头痛重要的生物学标记,通过WB和免疫荧光染色后发现在反复NTG注射后小鼠TCC部位CGRP表达增加（p＜0.01）。W146和FTY720则明显降低NTG诱导的CGRP释放（p＜0.001）。3.p-ERK和c-fos是中枢敏化重要指标。S1PR1拮抗剂W146和FTY720可明显降低反复NTG注射后诱导的小鼠TCC部位p-ERK和c-fos表达上调（p＜0.05）。结论在反复NTG注射的慢性偏头痛小鼠模型中S1PR1在蛋白及m RNA水平均表达上调,这提示S1PR1可能参与慢性偏头痛的发展。拮抗S1PR1后可明显缓解小鼠痛觉敏化,同时也降低了TCC部位CGRP,p-ERK及c-fos的表达,这进一步证实S1PR1参与慢性偏头痛中枢敏化。第二部分S1PR1介导小胶质细胞激活参与慢性偏头痛中枢敏化目的大量的研究显示小胶质细胞激活并通过分泌促炎因子与神经元建立相互作用,从而促进中枢敏化的发展。我们前期研究也发现反复NTG注射模型中三叉神经颈髓复合体中小胶质细胞激活可促进慢性偏头痛发展。S1PR1广泛表达于中枢神经系统,大量的研究表明拮抗S1PR1信号可抑制激活小胶质细胞激活从而缓解各种中枢神经系统疾病中的发展中。此外,在神经病理痛模型的研究中发现靶向S1PR1可减轻脊髓背角神经炎症反应。然而在慢性偏头痛中,拮抗S1PR1能否调控小胶质细胞从而缓解中枢敏化仍不清楚。因此在该部分我们将探讨S1PR1在慢性偏头痛中发挥作用的细胞及相关的分子机制,主要集中神经炎症方面。方法1.首先我们体外培养BV-2小胶质细胞,通过LPS刺激建立炎症模型。通过q PCR和免疫荧光染色技术观察小胶质细胞M1标记物i NOS在给予S1PR1拮抗剂后的表达变化。同时通过q PCR技术检测小胶质细胞释放的炎症因子表达变化。2.在体内动物模型中,通过免疫荧光染色和免疫印迹技术探索S1PR1拮抗剂对NTG诱导的TCC部位的小胶质细胞激活的影响。同时分析S1PR1拮抗剂对TCC部位炎症因子的表达情况。结果1.首先在离体研究中,我们发现S1PR1拮抗剂可明显抑制LPS诱导的小胶质细胞中i NOS的表达,并能在m RNA水平上抑制LPS刺激BV-2小胶质细胞产生的炎症因子IL-1β,TNF-a。2.在动物模型中,免疫荧光染色结果显示拮抗S1PR1可减少TCC区域Iba1的阳性细胞数（p＜0.001）,并且能减少小胶质细胞M1标记物i NOS蛋白表达水平（p＜0.05）。此外,免疫印迹结果显示拮抗S1PR1抑制了TCC区域TNF-α的表达。结论该部分研究发现拮抗S1PR1可明显抑制小胶质细胞活化及相关炎症介质的释放,提示S1PR1可能通过介导小胶质细胞激活来参与慢性偏头痛中枢敏化。第三部分S1PR1通过STAT3信号通路参与慢性偏头痛中枢敏化目的信号转导和转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3,STAT3）是参与细胞生长、增殖、分化和免疫调节的重要转录因子。在中枢神经系统疾病模型中,STAT3信号通路参与了小胶质细胞活化和神经炎症的调节。S1PR1是一种G蛋白偶联受体,可通过激活酪氨酸激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶来激活STAT3信号通路。因此,在该本部分探讨STAT3信号通路是否作为S1PR1下游通路介导小胶质细胞活化以及参与慢性偏头痛中枢敏化中。方法1.体外培养BV-2小胶质细胞,予以LPS（0.1ug/ul）刺激BV-2细胞,观察在炎症模型中不同时间点LPS刺激后STAT3信号通路的激活情况。再给予S1PR1受体拮抗剂预处理BV-2小胶质细胞观察STAT3通路的表达变化。2.建立反复NTG刺激的慢性偏头痛小鼠模型,通过免疫印迹方法观察在小鼠TCC部位STAT3表达变化,并通过免疫荧光染色进一步观察磷酸化的STAT3与小胶质细胞共定位的情况。再通过免疫印迹技术观察S1PR1受体拮抗剂对小鼠TCC部位STAT3的影响。3.在NTG注射前给予小鼠STAT3信号通路抑制剂AG490（20mg/kg,i.p）,进一步探讨STAT3信号通路是否参与到慢性偏头痛中枢敏化。将等体积的溶剂作为对照组（Vehicle,VEH）。在给药前及NTG注射后2小时检测小鼠眶周及后足足底的机械痛阈和热痛阈值变化,以反应AG490对慢性偏头痛的急性及预防治疗效果。同时免疫印迹方法和免疫荧光染色进一步观察AG490对TCC部位CGRP和c-fos表达变化的影响。最后通过免疫印迹方法和免疫荧光染色观察AG490对小胶质M1激活标志物i NOS的影响。结果（一）S1PR1对小胶质细胞中STAT3信号通路的调控1.在体外研究结果显示,随着LPS刺激时间的增加,BV-2小胶质细胞中p STAT3蛋白表达逐渐增加,在LPS刺激12小时后最明显（p＜0.05）。在W146和FTY720预处理后,LPS诱导的p STAT3明显减少,STAT3总量变化并不明显。2.在NTG诱导的CM小鼠模型中,免疫印迹结果显示p STAT3在TCC部位表达明显上调（p＜0.001）,并通过免疫荧光染色发现p-STAT3表达于小胶质细胞。p STAT3在TCC部位表达上调的趋势在给予小鼠S1PR1拮抗剂后下降。（二）STAT3信号通路参与慢性偏头痛中枢敏化1.行为学结果显示,AG490能明显缓解反复NTG给药诱导的基础机械和热痛痛觉敏化。同时在每次NTG注射后产生的急性痛觉敏化也能得到明显缓解（p＜0.05）。2.免疫印迹技术和免疫荧光染色结果显示,AG490可减少小鼠TCC部位CGRP和c-fos的表达上调（p＜0.001）。此外,AG490也能降低NTG诱导的小胶质细胞M1型激活标记物i NOS的表达。结论该部分研究结果表明S1PR1调控了STAT3信号通路的激活。抑制STAT3信号通路可明显缓解NTG诱导的小鼠急性和基础痛阈值降低,并能减少TCC部位CGRP的释放及c-fos的激活在NTG给药后。STAT3信号通路也有望成为慢性偏头痛临床治疗靶点。