糖尿病是一种以高血糖和细胞内环境稳态改变为特征的,涉及葡萄糖、蛋白质及脂质代谢紊乱的综合症,可导致血管损伤以及器官功能失调。糖尿病血管并发症是糖尿病最常见的慢性并发症,常见于心、脑、肾及视网膜,它是糖尿病病人致残、致死的主要原因之一,因此,国内、外学者十分关注糖尿病血管病变的机制研究以及寻找有效治疗药物。白细胞粘附到血管内皮是糖尿病血管病变的早期表现之一。高血糖通过一系列复杂的机制诱导内皮细胞大量表达和释放炎症因子,趋化因子、粘附分子,促使循环的白细胞、血小板粘附到内皮细胞表面,然后进入内皮下,进一步破坏内皮下组织。内皮细胞释放的与粘附密切相关的分子包括核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1.MCP-1)、P-选择素(P-selectin)、E-选择素(E-selectin)、粘附分子-1(VCAM-1)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)。核细胞趋化蛋白-1是很强的单核细胞趋化因子,它重要介导单核细胞和淋巴细胞向血管壁涌动,在血管内皮细胞损伤发生过程中具有十分重要的作用。P-选择素属于粘附分子中的选择素家族。它介导中性粒细胞在活化内皮细胞上的滚动,尤其在炎症过程的早期发挥重要作用,在炎症晚期同其他选择素分子协同发挥作用。E-选择素表达于炎症部位的内皮细胞主要介导白细胞在内皮细胞表面最初的滞留和滚动,以及随后迁移到炎症的组织。血管细胞粘附分子-1是免疫球蛋白超家族重要成员之一。主要介导淋巴细胞、单核细胞嗜酸细胞和内皮细胞的粘附。在细胞分化、炎症反应、动脉粥样硬化等多种疾病病理生理过程中发挥作用。细胞间粘附分子是免疫球蛋白超家族的成员之一,是一种重要的细胞表面粘附因子。内皮细胞上细胞间粘附分子参与白细胞穿越毛细血管壁到达炎症部位的过程。在高糖诱导的血管内皮细胞损伤过程中,这些分子协调介导粘附作用的发生。糖尿病血管并发症的发生主要由5条通路异常所致：包括多元醇通路代谢亢进；蛋白质糖基化及其终末产物(AGE)形成增加；蛋白激酶C (PKC)激活；己糖胺通路活性增高；核因子Kappa- B (nuclear factor-kappa B, NF-κB)的激活。在高糖诱导的血管内皮细胞损伤的机制中,活性氧(ROS)的增加扮演中心角色。酶、非酶及线粒体等因素影响ROS的产生。例如：NADPH氧化酶,黄嘌呤氧化酶,环氧合酶,细胞色素P450依赖性氧化酶,内皮型一氧化氮合成酶(eNOS),线粒体电子传递链,AGEs, PKC,活化的多元醇以及氨基已糖等一系列生化物质都可以导致ROS的过量产生。其中,线粒体内ROS的产生在糖尿病代谢综合征中起到关键作用。线粒体内的过量ROS刺激多个生理反应,如活化PKC,合成生长因子及细胞因子,激活NF-kB和NAPDH氧化酶等。因此,抑制氧化物的产生可以作为糖尿病血管综合症的一种治疗策略。核因子Kappa- B是一种具有广泛的转录调节作用的蛋白质,存在于多种细胞,参与炎症及免疫调控过程中的基因转录。NF-κB通常以p50/p65异源二聚体形式与κB抑制分子(inhibitory kappa B, IκB)结合,静息状态下,NF-κB以非活性状态与ⅠκB结合存在于胞质中,不具备调节基因转录能力。当细胞受到刺激时,刺激物通过特定信号通路激活ⅠκB激酶(IKK)复合物,引起ⅠκB32和36位的丝氨酸磷酸化,使其泛素化并被蛋白酶体降解,释放的NF-κB可转移到核内,与NF-κB依赖基因结合,调节包括细胞因子、粘附分子等的基因表达。在糖尿病血管病变过程中NF-κB信号通路通过多种途径活化。例如氧自由基大量产生后,可使NF-κB信号通路活化,导致MCP-1, VCAM-1, ICAM-2等因子的表达增加,导致单核细胞粘附到内皮细胞表面,随后迁入内皮间隙,进入内皮下。一氧化氮是一种新型生物信使分子,分布于生物体内各组织中,具有广泛的生物学活性,其生成依赖于一氧化氮合酶。一氧化氮合酶有三个亚型,包括内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)。eNOS是钙依赖蛋白酶,存在于血管内皮细胞,在生理状态下,被上游信号分子磷酸化,然后催化精氨酸合成NO,维持血管的生理功能,如血管张力和括约肌松弛等。eNOS是内皮功能完整的标志之一,正常情况下,eNOS合成NO,起保持内皮光滑完整,防止血栓形成的作用。柚皮苷全称为柚皮素-7-o-新橙皮糖苷,属二氢黄酮类化合物,是橘红、骨碎补、枳实、枳壳等中药的主要有效成分,具有广泛的生物学活性：包括抗氧化、降血糖、降血脂、抗动脉粥样硬化等生物学活性。柚皮苷可能对高糖诱导的脐静脉内皮细胞的粘附具有抑制作用。基于上述背景,本研究拟建立高糖诱导的脐静脉内皮细胞粘附模型,观察柚皮苷对高糖诱导的脐静脉内皮细胞与单核细胞的粘附作用的影响,并探讨可能的作用机制。研究的主要方法和结果如下：一、柚皮苷抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞与单核细胞的粘附33mmol/L的高糖诱导原代培养的内皮细胞48小时,然后采用荧光标记的单核细胞与诱导的内皮细胞共孵育3小时,建立粘附模型。然后用此模型来评价柚皮苷对内皮细胞与单核细胞粘附的抑制作用。荧光显微镜下观察到,对照组：11mmol/L的糖培养脐静脉内皮细胞48小时,少量单核THP-1细胞粘附于脐静脉内皮细胞；高糖组：33mmol/L的高糖诱导脐静脉内皮细胞48小时,粘附于脐静脉内皮细胞的THP-1细胞明显增加；同时采用荧光分光光度计检测结果表明,33mmol/L的高糖处理脐静脉内皮细胞48小时,明显诱导脐静脉内皮细胞与单核细胞粘附。本研究成功建立了高糖诱导的内皮细胞粘附模型。并首次发现,10、25、50μg/ml柚皮苷预处理脐静脉内皮细胞2小时明显抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞与单核THP-1细胞的粘附。二、柚皮苷抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞趋化因子和粘附分子的表达本研究采用ELISA方法研究了柚皮苷对高糖诱导的脐静脉内皮细胞趋化因子和粘附分子分泌和表面表达的影响。结果表明33mmol/L的高糖处理脐静脉内皮细胞48小时明显诱导核细胞趋化蛋白-1的分泌,及P-选择素、E-选择素、粘附分子-1和细胞间粘附分子-1的表面表达,与文献报道的一致。然而10、25、50μg/ml柚皮苷预处理脐静脉内皮细胞2小时明显抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞核细胞趋化蛋白-1的分泌,及P-选择素、E-选择素、粘附分子-1和细胞间粘附分子的表面表达。我们进一步采用Western blot技术研究柚皮苷对高糖诱导的脐静脉内皮细胞细胞粘附分子-1和细胞间粘附分子的蛋白表达的影响。结果表明10、25、50μg/ml柚皮苷预处理脐静脉内皮细胞2小时明显抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞细胞粘附分子-1和细胞间粘附分子的蛋白表达。进一步证实柚皮苷在整个细胞水平抑制粘附分子的表达。然后我们采用实时定量RT-PCT技术研究了柚皮苷对高糖诱导的脐静脉内皮细胞细胞粘附分子-1和细胞间粘附分子mRNA的表达。结果发现10、25、50μg/ml柚皮苷预处理脐静脉内皮细胞2小时明显抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞细胞粘附分子-1和细胞间粘附分子mRNA的表达。三、柚皮苷抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞氧自由基的产生本研究采用荧光探针进行活性氧检测,研究柚皮苷对高糖诱导的脐静脉内皮细胞活性氧产生的影响。结果表明10、25、50μg/ml柚皮苷预处理脐静脉内皮细胞4小时明显抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞活性氧的产生。四、柚皮苷抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞核因子-κB信号通路的活化我们采用Western blot和细胞免疫荧光技术研究了柚皮苷对核因子-kappa B信号通路的活化的影响。与对照组比较,33mmol/L的高糖处理脐静脉内皮细胞48小时明显增加了脐静脉内皮细胞核NF-κB p65的量；10～50μg/ml柚皮苷预处理脐静脉内皮细胞1小时,与高糖组比较,脐静脉内皮细胞核NF-κB p65的量明显减少。实验表明在高糖的刺激下NF-κB p65由胞浆向细胞核的转运增加,然而柚皮苷明显抑制了NF-κB p65由胞浆向细胞核的转运。与对照组比较,33mmol/L的高糖处理脐静脉内皮细胞48小时明显减少了脐静脉内皮细胞胞浆Ⅰ-κB的量；10～50μg/ml柚皮苷预处理脐静脉内皮细胞4小时,与高糖组比较,脐静脉内皮细胞胞浆Ⅰ-κB的量明显增加。实验表明在高糖的刺激下脐静脉内皮细胞胞浆Ⅰ-κB降解增加,然而柚皮苷明显抑制了胞浆Ⅰ-κB降解。接下来我们采用细胞免疫方法用荧光显微镜观察NF-κB p65由胞浆向胞核的转运,进一步证实柚皮苷抑制了NF-κB p65由胞浆向细胞核的转运。与对照组比较,在高糖处理组脐静脉内皮细胞核红色荧光明显增强,表明高糖增加了NF-κB p65由胞浆向细胞核的转运。25μg/ml柚皮苷预处理脐静脉内皮细胞4小时明显减少NF-κB p65由胞浆向细胞核的转运。五、柚皮苷逆转高糖诱导的脐静脉内皮细胞磷酸化eNOS的减少及NO产生的减少采用荧光探针进行一氧化氮产生的检测,研究柚皮苷对高糖诱导的脐静脉内皮细胞一氧化氮产生的影响。结果表明10、25、50μg/ml柚皮苷预处理脐静脉内皮细胞2小时明显逆转高糖诱导的脐静脉内皮细胞一氧化氮的产生。采用Western blot技术检测磷酸化eNOS的表达,结果表明10、25、50μg/ml柚皮苷预处理脐静脉内皮细胞2小时明显逆转高糖诱导的脐静脉内皮细胞磷酸化eNOS的表达,表明柚皮苷可能通过影响一氧化氮的产生发挥保护血管内皮细胞的作用。六、高糖及柚皮苷对脐静脉内皮细胞增殖的影响5～100μg/ml剂量范围内的柚皮苷处理脐静脉内皮细胞24、48和72 h后脐静脉内皮细胞的生长均受不受影响。说明抑制粘附的作用不是由于柚皮苷的细胞毒作用导致的。不同浓度葡萄糖：5.5、11、33、50mmol/L处理脐静脉内皮细胞24和48 h后,细胞的生长均受不受影响,表明33mmol/L葡萄糖培养脐静脉内皮细胞48h不影响细胞增殖。根据上述实验结果,本研究的结论如下：一、柚皮苷对高糖诱导的脐静脉内皮细胞与单核THP-1细胞的粘附具有明显的抑制作用。二、柚皮苷明显抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞核细胞趋化蛋白-1、P-选择素、E-选择素、粘附分子-1和细胞间粘附分子的表达。三、柚皮昔明显抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞氧自由基的产生。四、柚皮苷抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞核因子-κB信号通路的活化。五、柚皮苷明显逆转高糖诱导的脐静脉内皮细胞磷酸化eNOS的减少及一氧化氮产生的减少。综上所述,柚皮苷通过抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞活性氧的产生,从而抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞核因子-κB信号通路的活化,抑制粘附分子在基因和蛋白水平的表达,进一步抑制单核细胞与内皮细胞的粘附,发挥抗炎、抗动脉粥样硬化的作用。柚皮苷通过逆转高糖诱导的脐静脉内皮磷酸化eNOS的减少,从而逆转高糖诱导的脐静脉内皮细胞一氧化氮产生的减少,表明柚皮苷可能通过影响一氧化氮的产生发挥保护血管的作用