论文部分内容阅读
目的分离培养大鼠的坐骨神经雪旺氏细胞(Schwann cells,SC)，在体外观察糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGE）对雪旺氏细胞表型和功能的影响，为进一步探讨糖尿病周围神经病变的发生机制提供实验依据。方法1分离培养Wistar大鼠坐骨神经的雪旺氏细胞，并分别用免疫组化、RT-PCR、Western-blot及免疫荧光检测雪旺氏细胞标志物髓鞘碱性蛋白（myelin basicprotein,MBP）和S100蛋白的表达；用流式细胞仪来检测雪旺氏细胞的纯度。2MTT法检测AGE影响雪旺氏细胞增殖的时效和量效关系，确定AGE的最佳作用剂量和作用时间。3200μg/ml AGE作用于雪旺氏细胞48h后，经台盼蓝染色观察AGE引起细胞死亡的方式，分析坏死细胞的比例；再经TUNEL染色观察细胞的凋亡情况。4通过实时荧光定量PCR、Western-blot和流式细胞术检测AGE对雪旺氏细胞RAGE、iNOS、PKA、PKC和SOD mRNA和蛋白表达的影响，以进一步探讨AGE损伤雪旺氏细胞可能的机制。结果1刚分离的雪旺氏细胞初期呈“串珠样”结构，12h后“串珠样”结构开始解体，逐渐变为椭圆形，24h后细胞开始贴壁，48h左右长成局部克隆，3～5天左右生长至80%～90%的汇合。而贴壁生长的雪旺氏细胞大多呈长梭形，双极。免疫组化、RT-PCR、Western-blot及免疫荧光的结果显示MBP和S100在雪旺氏细胞中的表达；流式细胞术结果显示分离培养的雪旺氏细胞纯度达到90%以上。2MTT结果显示，与正常培养组相比较，100μg/ml AGE组的增殖速度没有明显的差别，而200μg/ml和400μg/ml AGE从第三天开始明显的抑制雪旺氏细胞的增殖，差异有统计学意义（P<0.05）。3台盼蓝染色结果表明，与正常培养组相比较，200μg/ml AGE组坏死的雪旺氏细胞比例达到9.41%，差异有统计学意义（P<0.05）；TUNEl染色结果显示，与正常培养组相比较，AGE诱导组的雪旺氏细胞凋亡率达到20.3%，差异有统计学意义（P<0.05）。4实时荧光定量PCR、Western-blot和流式细胞术结果显示，与正常培养组相比较，AGE诱导组的RAGE、PKC和iNOS的表达水平明显上调，而PKA和SOD的表达水平明显下调，差异有统计学意义（P<0.05）。结论1成功分离培养大鼠坐骨神经雪旺氏细胞，纯度达90%以上。2AGE可抑制雪旺氏细胞的增殖，促进凋亡。3AGE可上调雪旺氏细胞RAGE的表达，说明AGE诱导雪旺氏细胞的凋亡可能与AGE-RAGE的相互作用有关。4AGE可促进雪旺氏细胞中NO和ROS生成，同时上调RAGE、iNOS和PKC的表达，下调PKA和SOD的表达，说明AGE损伤雪旺氏细胞与增强氧化应激反应、激活PKC、抑制PKA的活性有关。