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三酰甘油（triacylglycerol,TAG）是植物油脂的主要成分,可由二酰甘油酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferase,DGAT）或磷脂:二酰甘油酰基转移酶（phospholipids:diacylglycerol acyltransferase,PDAT）催化生成。长链非编码 RNAs（long non-coding RNAs,lncRNAs）作为细胞过程的关键调控因子,能够以RNA分子的形式在表观遗传、转录及转录后等多个层面调控基因的表达,但其在花生油脂合成中的作用还有待深入研究。因此本研究以花生为实验材料,结合mRNAs与lncRNAs表达谱,在花生基因组中鉴定油脂合成相关的lncRNAs并挖掘新的TAG合成关键基因（AhDGAT和AhPDAT）,系统研究其在油脂合成中的作用,揭示其分子调控机制,为花生高油育种和品质改良提供理论基础。1.全基因组鉴定和分析花生lncRNAs采用转录组测序技术结合生物信息学鉴定花生lncRNAs,并通过PCR和RT-qPCR进行验证。鉴定到一批可能参与花生油脂合成的lncRNAs及其靶基因。结果如下:（1）全基因组共鉴定1,442个花生lncRNAs,189个lncRNA在根、叶或种子中差异表达。（2）花生lncRNAs表达具有组织特异性和时空特异性,其表达水平和可变剪接率低于mRNAs。部分编码蛋白的基因在剪接过程产生一些不能编码的转录本,我们认为可以将其作为lncRNAs的一个新来源.（3）三个花生 lncRNA（AhlncR1,AhlncR2,AhlncR3）的靶基因大部分为AhPDAT1,推测这些lncRNAs可能作为AhPDAT1的反式调控因子参与花生油脂代谢。对AhlncR1进行扩增得到2条剪接异构体,分别命名为AhlncR1.1和AhlncR1.2,预测二者反式调控AhPDAT1基因,随后对AhPDAT1和AhlncR1在油脂合成中相互作用展开验证。2.AhPDAT1的鉴定与功能分析（1）花生AhPDAT家族基因鉴定分析。通过生物信息学方法,结合栽培花生基因组数据和转录组数据,共检测到17个AhPDAT家族成员,分布于9条染色体上;基因结构分析显示,它们具有2-8个外显子,编码88-742个氨基酸;进化分析显示AhPDATs与大豆、苜蓿以及菜豆亲缘关系较近;表达模式分析发现,各成员组织表达特征多样化,说明它们功能分工的不同。同时,该家族基因还存在丰富的可变剪接类型,其中以Aradu.S9XBY的可变剪接体最多。（2）AhPDATs基因克隆与表达模式分析。从花生中克隆到6条转录本,分别属于两对等位基因,依次命名为AhPDAT1A、AhPDAT1B-1、AhPDAT1B-2和AhPDAT2A-1、AhPDAT2A-2、AhPDAT2B。设计Taqman荧光探针对各个剪接异构体的表达模式进行验证,由于没有找到AhPDAT1B-2的特异性探针,故未对该转录本进行表达模式分析。结果显示AhPDA T1和AhPDAT2表达模式相似,均在果针入土15 d时表达量最高,其次是果针入土 30 d、根和花,而在果针入土 45 d和60 d时表达较低。不同之处是AhPDAT1A在花中的表达显著高于AhPDAT1B-1,而在果针入土 60 d时显著低于AhPDAT1B-1。（3）利用TAG合成缺陷突变酵母菌株H1246验证AhPDAT1和AhPDAT2功能。AhPDAT1A与AhPDAT2A-1、AhPDAT2A-2、AhPDA T2B均可编码完整蛋白并能恢复H1246的TAG合成功能,而AhPDAT1B-1、AhPDAT1B-2由于编码提前终止不能表达蛋白,故未能恢复H1246的TAG合成功能。为进一步验证AhPDAT1B-1、AhPDAT1B-2是否能够影响AhPDAT1A的功能,构建AhPDAT1A+1B-1和AhPDAT1A+1B-2双基因共表达载体转化酵母,发现均能恢复H1246的TAG合成功能;Western blot结果显示,双基因共表达载体转化酵母的AhPDAT1A蛋白表达均略有所降低。3.验证 AhlncR1 与AhPDAT1A互作。（1）Western blot结果显示AhlncR1.1和AhlncR1.2均未编码任何蛋白产物,与空载相比,转单基因酵母菌株的油脂含量几乎没有变化,即AhlncR1对H1246油脂合成没有影响。（2）构建AhPDAT1A+AhlncR1.1和AhPDAT1A+AhlncR1.2双基因共表达载体,转化酵母均能恢复 H1246 的 TAG 合成功能。AhPDAT1A+AhlncR1.1和 AhPDAT1A+AhlncR1.2转双基因酵母菌株油脂含量均显著低于AhPDAT1A转基因酵母菌株。4.可变剪接调控花生AhDGAT2-Like功能前期研究发现部分lncRNA来源于编码基因,因此拟对这类lncRNA的功能进行研究。在AhDGAT2基因亚家族中,Aradu.Z4DIZ与其它AhDGAT2的相似性仅有64.67%,故命名为AhDGAT2-Like,其5条剪接异构体依次命名为AhDGAT2-L1.1-1.5,其中只有AhDGAT2-L1.1可编码完整蛋白,我们推测其余四个剪接异构体可能作为lncRNA对AhDGAT2-L1.1发挥作用。为此本部分实验从以下四个方面展开研究:（1）花生AhDGAT家族基因鉴定分析。在花生基因组中共鉴定到29条DGAT基因,聚集到4个独立分支,依次为DGAT1、DGAT2、DGAT3和WSD四个亚家族。其中DGAT1的成员最少,且与DGAT2亲缘关系最近,与WSD的亲缘关系最远。同时,各亚家族有自己独特的保守结构域,其基因结构、内含子数目、跨膜区数目、表达模式、亚细胞定位、可变剪接情况存在一定差异。（2）Taqman荧光定量PCR检测AhDGAT2-L1.1-1.5表达模式分析。在种子中,AhDGAT2-L1.2-1.5在果针入土15 d、30 d的种子中表达量最高,AhDGAT2-L1.3在60 d的种子中不表达。AhDGAT2-L1.3在茎中表达最高,而在根和花未表达;AhDGAT2-L1.4仅在根中表达;AhDGAT2-L1.5在根中表达量最高,在叶和花中表达量最低。（3）AhDGAT2-Like各剪接异构体的功能验证。五个剪接异构体分别在H1246中过表达,仅有AhDGAT2-L1.1能够恢复突变酵母菌株合成TAG的能力,且转基因酵母的总油脂和脂肪酸含量均显著高于对照;AhDGAT2-L1.2-1.5不能恢复突变体合成TAG的能力,是由于这4个剪接异构体不能编码蛋白所致。（4）验证 AhDGAT2-L1.2-1.5 与AhDGAT2-L1.1的互作。为探究 AhDGAT2-L1.2-1.5 是否能作为 lncRNAs 参与调节AhDGAT2-L1.1 的表达,分别构建AhDGAT2-L1.2/1.3/1.4/1.5+1.1四个双基因共表达载体转化H1246验证其功能。结果表明这4个转双基因酵母均具有TAG合成能力,与AhDGAT2-L1.1相比,其油脂含量和脂肪酸组成均发生不同程度的改变。油脂含量方面,AhDGAT2-L1.2+1.1和AhDGAT2-L1.3+1.1两个转基因株系总油脂显著低于AhDGAT2-L1.1,AhDGAT2-L1.4+1.1与AhDGAT2-L1.1基本持平,而AhDGAT2-L1.5+1.1则显著高于AhDGAT2-L1.1。脂肪酸组成方面,与AhDGAT2-L1.1转基因酵母相比,其脂肪组成均发生了变化,4种主要脂肪酸所占比例都有所下降,说明转双基因酵母的底物特异性发生了改变。Western blot实验表明,AhDGAT2-L1.2-1.5不编码蛋白,却能够以RNA分子的形式影响AhDGAT2-L1.1的功能,进而影响TAG的生物合成。总结:本论文研究表明,AhlncR1能够以RNA分子形式调节油脂合成关键基因AhPDAT1A的酶活性,影响了油脂积累,进而参与油脂代谢。相似地,AhDGAT2-Like的四个不能编码蛋白的剪接异构体能够调节编码基因AhDGAT2-L1.1的功能,推测它们与lncRNA具有类似的作用方式。然而lncRNA与功能基因之间的精细调控机制尚不清楚,仍需深入研究。