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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以关节受累为主要表现的自身免疫性疾病,其主要病理特点是免疫细胞异常活化,多种炎性免疫细胞浸润至滑膜组织中,引起滑膜细胞类肿瘤样剧烈增生,形成血管翳,侵蚀软骨和骨组织,最终导致关节畸形和功能丧失。RA的早期诊断除主诉和体征检查外,主要依赖血沉、类风湿因子(rheumatoid factor,RF)和抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide,CCP)抗体等实验室检查指标,其中RF和抗CCP抗体均为自身抗体,提示B淋巴细胞活化,浆细胞过度克隆,大量自身抗体产生是RA的重要病理机制之一。经抗原刺激异常增殖活化的B淋巴细胞发育分化为记忆B细胞和分泌高亲和力抗体的浆细胞。Blimp-1作为“B淋巴细胞终极分化的主调控子”,是促进浆细胞表型分化和抗体分泌的重要转录因子。自身反应性B淋巴细胞产生的自身抗体对自身组织进行攻击并引起抗体介导的免疫反应,累及多个器官,对机体造成损害,介导RA的发生发展。因此,B淋巴细胞的过度活化和分化产生的过量浆细胞在RA的发生发展中发挥重要病理作用,是抗RA治疗的一个重要靶点。研究发现,Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)介导的信号转导在B淋巴细胞分化为浆细胞过程中扮演重要角色。TLR4是TLR家族中识别病原微生物的重要成员,其为介导Gram阴性菌细胞壁主要成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)应答的最主要受体,几乎在所有细胞中都有表达。当TLR4受到配体刺激后,下游的接头蛋白肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNFR-associated factor 6,TRAF6)与白细胞介素-1受体相关激酶1/4(interleukin-1 receptor associated kinase,IRAK1/4)一起被募集到髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)上形成复合物,从而使 TRAF6 发生泛素化寡聚化,活化转化生长因子-β活性激酶1(transforming growth factor-β-activation kinase 1,TAK1),随后TAK1激活核因子-κB抑制蛋白激酶家族(inhibitor of nuclear factor-κB kinases,IKKs),活化的 IKKs 使核因子-κB 抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor-κB,IκB)磷酸化降解,核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)转位入核启动Blimp-1转录。由于膜TLR4是上述促进浆细胞形成信号转导的启动分子,在RA病程中,其不断接受配体刺激促进B淋巴细胞的过度分化,经典的RA动物模型即通过注射LPS或卡介苗激活TLR4建立,因此对TLR4功能的调控在维持免疫平衡中具有重要意义。除TLR4的作用,近年来,作为最大受体超家族的G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR)对免疫细胞功能的调控逐渐被关注。GPCR通过调控细胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)水平决定免疫细胞的活化和功能发挥。RA患者体内多种GPCR的配体包括前列腺素、腺苷、趋化因子等水平显著升高,受体被激活。GPCR主要被GPCR激酶(G protein coupled receptor kinase,GRK)和β_抑制蛋白(β-arrestin,β-arr)负性调控,当受体被GRK磷酸化后,β-arr2介导绝大多数GPCRs的内吞、脱敏等。已有研究发现β-arr2除介导GPCRs的内吞外,还能介导一些非GPCR例如生长因子受体的内吞,阻止下游信号转导。多项研究表明,β-arr2具有抗炎作用,β-arr2-/-小鼠关节炎症较野生型(wild type,WT)小鼠更为严重,但具体机制尚不清楚。预实验发现,β-arr2-/-小鼠建立的胶原抗体诱导的关节炎(collagen antibodies induced arthritis,CAIA)中脾脏浆细胞百分比较野生型CAIA小鼠显著增多,提示β-arr2参与了浆细胞的分化过程,但分子机制需要阐明。本课题组将白芍总苷的有效活性成分Pae进行酯化修饰合成后得到的新型活性单体药物CP-25可有效抑制胶原性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠B淋巴细胞活化,减少IgG1和IgG2A的分泌,提示CP-25对于浆细胞生成具有明确的抑制作用,但具体作用机理不清楚。CP-25是否通过影响β-arr2功能调节浆细胞形成的有待阐明。为揭示β-arr2在关节炎小鼠浆细胞形成中的调控作用及CP-25的影响,本课题建立β-arr2-/-和WT小鼠CAIA模型,在整体水平上观察β-arr2在关节炎病程和浆细胞分化中的作用;采用β-arr2-/-和WT小鼠CAIA模型、TNP-LPS诱导的体液免疫反应模型,以及体外用LPS刺激β-arr2-/-和WT小鼠脾脏B淋巴细胞,研究β-arr2对B淋巴细胞TLR4信号的调节和在浆细胞分化中的作用机制;同时给予CP-25治疗CIA小鼠,阐明CP-25对关节炎小鼠浆细胞分化的影响和对β-arr2的调控作用。目的:观察β-arr2对RA疾病病程和浆细胞生成的影响;揭示β-arr2对TLR4介导的浆细胞分化信号的调控作用;明确CP-25对β-arr2功能的调控及抑制浆细胞分化的药理作用机制。方法:为观察β-arr2在RA病程和浆细胞产生中的作用,建立β-arr2-/-和WT小鼠CAIA模型,观察小鼠整体指标(体重、胸腺指数、脾脏指数、关节肿胀数和关节炎指数),采用H&E染色进行脾脏及踝关节病理学检查;采用超声影像学检测小鼠膝关节肿胀程度和血流信号;流式细胞术检测CAIA小鼠脾脏浆细胞(CD19-CD138+)和记忆B细胞(CD19+CD27+)百分比;ELISA法检测CAIA小鼠外周血血清中IgG1和IgG2A水平。为进一步揭示β-arr2对TLR4介导的浆细胞分化信号的调控作用,免疫荧光法检测β-arr2-/-和WT CAIA小鼠脾脏B淋巴细胞TLR4与β-arr2的结合情况以及NF-κB核转位情况;流式细胞术检测B淋巴细胞上TLR4的胞膜表达水平;Western blot法检测B淋巴细胞胞质内TLR4蛋白表达量;采用TNP-LPS腹腔注射,直接激活β-arr2-/-和WT小鼠B淋巴细胞的TLR4受体,成像流式检测小鼠脾脏浆细胞比例;体外分离出β-arr2-/-和WT小鼠脾脏B淋巴细胞采用LPS刺激,CCK-8法检测LPS体外刺激对B淋巴细胞活力的影响;流式细胞术检测B淋巴细胞分化为浆细胞(CD19-CD138+)和记忆B细胞(CD19+CD27+)的百分比;qPCR检测核转录因子Blimp1-mRNA的表达水平;采用LPS+白介素-4(interleukin-4,IL-4)诱导B淋巴细胞产生IgG1或采用LPS+γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)诱导B淋巴细胞产生IgG2A,ELISA法检测B淋巴细胞培养上清中IgG1和IgG2A抗体产生水平。为明确CP-25减少浆细胞形成的药理作用机制,建立DBA/1小鼠CIA模型,观察CP-25对CIA小鼠整体指标(关节肿胀数、关节炎指数)和踝关节病理学改变(H&E染色)的影响;流式细胞术检测CP-25对CIA小鼠脾脏浆细胞百分比以及B淋巴细胞上TLR4胞膜表达的影响;免疫荧光法检测CIA小鼠脾脏B淋巴细胞β-arr2与TLR4以及β-arr2与GRK2的共定位情况;Western blot法检测CP-25对CIA小鼠B淋巴细胞胞质内TLR4蛋白分布的影响。结果:1.敲除β-arr2可加重CAIA小鼠的整体指标建立β-arr2-/-和WT小鼠CAIA模型,与WT-CAIA小鼠相比,β-arr2-/--CAIA小鼠从造模d10开始体重下降更加明显;而在病程的d 9-10,β-arr2-/--CAIA小鼠关节肿胀数和关节炎指数升高更为明显;超声影像学检测发现β-arr2-/--CAIA小鼠膝关节肿胀更为明显;与WT-CAIA小鼠相比,β-arr2-/--CAIA小鼠关节可见更加明显的炎细胞浸润、血管翳出现、骨侵蚀和滑膜组织增生,脾脏病理学改变更加严重;脾脏指数较高,胸腺指数较低。结果提示,敲除β-arr2将导致更为严重的关节炎症,提示β-arr2在实验性关节炎的发生发展中起到重要的保护作用。2.敲除β-arr2使CAIA小鼠脾脏浆细胞形成增多并产生更多抗体与WT-CAIA小鼠相比,β-arr2-/--CAIA小鼠脾脏浆细胞(CD19-CD138+)以及记忆B细胞(CD19+CD27+)百分比均明显增高,血清IgG1和IgG2A水平较高,即缺失β-arr2可致关节炎小鼠浆细胞形成及抗体产生增多,提示β-arr2在关节炎小鼠浆细胞分化过程中起到抑制作用。3.敲除β-arr2使CAIA小鼠脾脏B淋巴细胞TLR4胞膜分布增多,信号转导增强和正常WT小鼠相比,WT-CAIA小鼠B淋巴细胞膜上TLR4表达明显升高,TLR4与β-arr2共定位显著增多,NF-κB核转位增多;与WT-CAIA小鼠相比,β-arr2-/--CAIA小鼠脾脏B淋巴细胞胞膜TLR4表达进一步增多,而胞质表达水平明显减少,NF-κB核转位更多。以上结果表明,炎症状态下,B淋巴细胞中TLR4信号被活化,β-arr2与TLR4结合较多,敲除β-arr2使TLR4胞膜分布更多,下游NF-κB活化更为明显,提示β-arr2可能通过与TLR4结合,通过减少B淋巴细胞膜上TLR4分布,抑制其下游NF-κB活化,而减少浆细胞的生成。4.敲除β-arr2进一步增加TNP-LPS腹腔注射小鼠体内浆细胞的生成采用TNP-LPS腹腔注射β-arr2-/-和WT小鼠,激活TLR4信号,诱导体内B淋巴细胞活化和分化,注射d14后检测发现,与正常WT小鼠相比,WT-TNP-LPS小鼠脾脏浆细胞比例显著增多,外周血IgG1和IgG2A水平也显著升高;与WT-TNP-LPS小鼠相比,β-arr2-/--TNP-LPS小鼠脾脏浆细胞生成更多,血清IgG1和IgG2A水平也进一步增高,表明敲除β-arr2可进一步促进TNP-LPS诱导的浆细胞分化和抗体产生。本结果提示TLR4信号介导的浆细胞分化受到β-arr2的显著负调控。5.缺失β-arr2引起TLR4胞膜分布增多,而增加LPS体外刺激的小鼠B淋巴细胞向浆细胞分化体外用 LPS 或 LPS+白介素-4(interleukin-4,IL-4)/γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)刺激诱导β-arr2-/--和WT小鼠脾脏B淋巴细胞,检测发现,与未刺激细胞相比,体外刺激显著增加WT小鼠B淋巴细胞TLR4总表达和胞质胞膜分布以及β-arr2与TLR4共定位,增强NF-κB核转位,提高B淋巴细胞活力,浆细胞百分比及IgG1和IgG2A产生。与WT-LPS刺激组相比,β-arr2-/-B淋巴细胞在LPS或LPS+IL-4/IFN-γ刺激下B淋巴细胞TLR4总表达未见明显改变,而胞质分布减少,胞膜分布增多,NF-κB核转位进一步增加,B淋巴细胞活力进一步增强,浆细胞百分比及IgG1和IgG2A产生更多。以上结果表明,在LPS等刺激下,缺失β-arr2使B淋巴细胞胞膜上的TLR4分布增加,下游信号异常高度活化,浆细胞分化显著增多。提示,β-arr2通过减少B淋巴细胞膜上TLR4分布,抑制其下游NF-κB活化,阻止LPS等诱导的浆细胞分化。6.CP-25显著抑制CIA小鼠关节炎症及整体指标与正常小鼠相比,CIA小鼠较多关节发生肿胀,关节肿胀数和关节炎指数高,CIA小鼠关节H&E染色显示明显的病理改变,CP-25灌胃给药可明显抑制关节炎症及病理改变,并改善上述整体指标,提示CP-25对关节炎症具有明显的抑制作用。7.CP-25恢复β-arr2对TLR4信号的调控减少CIA小鼠浆细胞生成与正常小鼠相比,CIA小鼠脾脏浆细胞比例显著升高,B淋巴细胞胞膜和胞质TLR4表达均显著升高,β-arr2与TLR4和GRK2均有较多共定位。CP-25明显降低浆细胞比例至接近正常水平;免疫荧光检测发现CP-25减少了 GRK2与β-arr2的共定位,促进了 β-arr2与TLR4的共定位,减少TLR4胞膜分布,使更多TLR4分布于胞质中。以上结果提示CP-25可能通过减少B淋巴细胞中GRK2对β-arr2的募集,恢复β-arr2对TLR4信号的负调而发挥抑制浆细胞生成和抗炎作用。结论:1.β-arr2阻止炎症状态下浆细胞分化和抗体的过度产生,在RA疾病的发生发展中起改善作用。2.β-arr2通过与B淋巴细胞上TLR4结合,减少TLR4胞膜分布,抑制其下游信号转导而阻止B淋巴细胞分化为浆细胞,改善关节炎症。3.CP-25可能通过减少B淋巴细胞中GRK2对β-arr2的募集,恢复β-arr2对TLR4信号的负调而减少浆细胞生成和抗体产生,发挥抗炎作用。