研究背景：病毒性肝炎、酒精中毒、血吸虫感染等导致的慢性肝病是我国最多发的常见病之一。慢性肝病(主要是慢性病毒性肝炎)的重要病理基础是肝纤维化。肝纤维化可进一步发展为肝硬化甚至肝癌,患者病死率相当高,生活质量也相当差。目前公认,肝纤维化有时可以逆转但肝硬化是难以逆转。因此,面对慢性肝炎,一方面抗病毒仍是根本性治疗,但另一方面,在抗病毒无特效治疗的基础上,另一重要的治疗手段必须提上日程,即抗肝纤维化的早期诊治。如能阻断、减轻乃至逆转肝纤维化,就能在很大程度上改善各种肝病的预后,而肝纤维化的早期检测是肝纤维化早期干预的前提。肝组织活检是肝纤维化检测的“金标准”,但作为有创检测其临床应用尚难以广泛开展。目前肝纤维化临床诊治困难,虽然常通过检测血清HA、P111P、CIV、LN等协助间接推测肝纤维化程度,但这些指标不能早期准确反映肝纤维化,故寻找准确无创的早期肝纤维化检测手段就十分必要和迫切。近年研究表明,miRNA这一转录后水平调控因子可通过调控细胞增殖、凋亡、脂代谢/脂肪酸代谢等一系列相关通路在许多肝脏疾病的发生发展过程中发挥重要作用。国内外学者采用高通量芯片、RT-RCR等技术对动物肝纤维化组织及临床病人肝组织研究发现,多种miRNAs在肝纤维化进程中差异表达。业已发现niR-199a,miR-199a*, miR-200a和]miR-200b在CCL4肝纤维化动物组织与人的肝纤维化组织中均差异性表达,并且与肝纤维化分级显著相关。在HSC活化增殖进程中确认差异性表达的miRNA有21种,miRNA的差异性表达与其活化增殖的发生密切相关,例如过表达的miR-29和miR-19b都可通过下调促纤维化因子的表达而抑制ECM合成。提示miRNA可能参与调控HSC生物学行为而影响肝纤维化的发生发展。可见microRNA在慢性肝病的发生发展机制中扮演重要角色,但可用于肝纤维化病理分级或早期诊断的血循环miRNA未见报道。microRNA被认为是重要的传递细胞内信息的循环核,在血液中有异常高的稳定性,提示循环miRNA分子可能成为无创诊断疾病的一个有效的方法。有人研究报道miR-122和miR-155可能是丙肝患者炎症介导的肝损伤标志物。有人在慢性乙型肝炎患者血浆样本中检测了与肝病相关的9个miRNAs,发现3个(miR-199a、miR-125b和miR-122)的表达量的变化具有统计学意义,其中miR-122的变化最为显著。提示血液中可能存在稳定易检测的1miRNA,对于早期尚未明确诊断或晚期肝纤维化患者具有潜在的应用价值。本课题拟通过检测二甲基亚硝胺(Dimethylnitrosamine, DMN)诱导的肝纤维化模型大鼠血液中miRNA表达谱,筛选肝纤维化进程中外周血中差异表达的miRNAs,并在DMN和BDL大鼠肝纤维化模型中进行验证,通过相关生物信息学及统计分析,筛选出与肝纤维化相关的特异miRNAs;收集乙肝肝纤维化患者临床血标本,检测目标microRNA在HBV感染患者外周血样本的表达,构建ROC曲线,计算目标microRNA对肝纤维化的诊断的敏感度与特异度,分析目标microRNA在肝纤维化中的诊断效率,即通过测定外周血microRNA的浓度来判定肝纤维化的程度,为肝纤维化早期检测提供新的依据和方法,尤其在肝纤维化早期进行定性定量监测,可有效指导早期抗纤维化治疗及其疗效评估。第一部分：大鼠肝纤维化模型建立目的：建立DMN、BDL两种大鼠肝纤维化模型,观察大鼠的一般情况及大鼠肝脏病理组织学改变,对大鼠肝组织进行分级分期,收集不同肝纤维化分期的大鼠的外周血标本,为下一步miRNA芯片筛选及PCR验证准备。方法：DMN模型：对SD大鼠行DMN连续腹腔内注射建立DMN大鼠肝纤维化模型,对照组给予腹腔注射同等剂量的生理盐水；BDL模型：对SD大鼠胆总管肝门处上下结扎(bile duct ligated, BDL),并从中间间断,导致胆汁淤积,建立BDL胆汁淤积型肝纤维化模型。定期观察大鼠一般情况改变并处死,处死大鼠前进行戊巴比妥腹腔注射麻醉,进行腹主动脉采血到PAXgeneTM Blood RNA Tube采血管中,上下颠倒混匀,常温静置4小时后,-20℃冻存;取肝组织进行HE染色、Masson及VG特殊染色并进行病理学观察,判断大鼠肝纤维化程度。结果：(1)随着造模周期延续,大鼠一般情况都发生相应改变：DMN模型组大鼠在各时间段活动和排便减少,体毛密度和光泽度变差,体重及肝重均低于对照组；BDL模型组：大鼠的活动和排便减少、体毛密度和光泽度变差,由于胆汁淤积导致体重及肝重增加；(2)DMN造模早期由于炎症大鼠肝脏较正常组稍大,后期肝纤维化肝硬化后肝脏体积则小于对照组、肝脏表面可呈灰黄色细颗粒状；BDL造模组大鼠肝脏较正常组增大明显,肝色泽变黄尤以肝门附近明显(胆汁淤积),后期肝脏逐渐变韧,表面略显粗糙、偶呈细颗粒状；(3)HE染色及MassoN、VG特殊染色观察：对照组肝小叶结构完整,肝细胞以中央静脉为中心向周围呈放射状排列,未见明显变性；DMN模型组均可见肝细胞浊肿、变性及坏死,可见少量炎性细胞渗出,门管区和小叶内胶原纤维增生,形成纤维间隔、并最终可出现假小叶;BDL模型组可见胶原纤维增生(以门管区为主),同时门管处胆管也明显增生,最终可形成胆汁淤积性肝硬化样改变；(4)大鼠的外周血采集到PAXgeneTM Blood RNA Tube管(因采血管中内含稳定体内基因转录性状的添加剂,-20℃可保存50个月),可应用于芯片检测及后期的验证。结论：对SD大鼠行DMN连续腹腔内注射可成功建立DMN大鼠肝纤维化模型；对SD大鼠胆总管肝门处上下结扎,导致胆汁淤积,可成功建立BDL胆汁淤积型肝纤维化模型。根据病理分期分级,并将大鼠的血标本进行分组,可用于芯片检测。第二部分：肝纤维化动物模型外周血特异microRNAs的筛选及验证目的：研究外周血循环miRNAs在肝纤维化进程中的差异表达情况,并在DMN及BDL,大鼠肝纤维化模型外周血标本中进行验证,筛选出肝纤维化相关的差异表达显著的miRNAs,作为下一步临床血标本验证的目标microRNA。方法：(1)根据前期肝纤维化组织病理分期结果选取DMN模型组中和BDL模型组中各级肝纤维化大鼠的血标本,利用miRNA芯片初步筛选出在各级肝纤维化外周血循环中差异性表达的1miRNAs;(2)应用实时定量PCR检测目标microRNA在DMN模型组中和BDL模型组中不同级别肝纤维化外周血中的表达；(3)结合文献报道及靶基因预测网站,进一步挑选出在外周血循环中高丰度存在、且随肝纤维化进程显著差异表达的miRNAs;(4)在DMN模型组中和BDL模型组中不同级别肝纤维化外周血中进行验证。结果：(1) miRNA芯片分析结果表明,随着肝纤维化发展,肝纤维化外周血循环中有37条miRNAs差异表达,其中miR-185上调水平最高,与对照组相比,表达水平增加最大,故选择miR-185在DMN和BDL模型大鼠的外周血中进行进一步的验证；(2)实时定量PCR检测显示：miR-185在DMN肝纤维化模型外周血中随肝纤维化进程其表达量显著增加；在早期肝纤维化(F1/F2)和晚期肝纤维化(F3/F4)鼠例中分别升高4.15和5.87倍,晚期较早期miR-185表达量有所增加,且有统计学意义；(3)实时定量PCR检测显示miR-185在BDL肝纤维化模型外周血中随肝纤维化进程其表达量显著增加；在早期肝纤维化(F1/F2)和晚期肝纤维化(F3/F4)鼠例中分别升高1.70和1.9倍,晚期较早期miR-185表达量有所增加,但无统计学意义；(4)miR-185在DMN和BDL在两种肝纤维化模型中表达量变化趋势一致,随肝纤维化进程其表达显著增加,推测miR-185可作为肝纤维化的循环标志物。结论：肝纤维化进程外周血循环中存在miRNA差异性表达,miR-185在DMN和DBL两种肝纤维化模型中的变化趋势一致,随肝纤维化进程其表达显著增加,miR-185可作为肝纤维化的循环标志物第三部分：循环m i R-185对临床肝纤维化诊断价值的研究目的：芯片筛选及两种动物模型验证后,确定的miR-185在乙肝肝纤维化患者外周血中进行检测,明确这miR-185在临床诊断中的作用及价值。方法：(1)从福州军区总院募集乙肝肝纤维化患者的外周血标本；(2)利用实时定量PCR检测miR-185在肝纤维化患者外周血中的表达水平：(3)统计这些已收集血标本的临床病人病历,并根据其肝穿活检的病理结果进行分组；(4)结合金标准病理诊断及miR-185在临床血样本中的表达结果进行统计分析,构建ROC曲线,计算据miR-185值诊断不同肝纤维化分期的特异度和敏感度,以ROC曲线下面积,明确这miR-185在肝纤维化临床诊断中的作用及价值。结果：(1)在HBV感染患者的外周血中miR-185随肝纤维化进展其表达量显著增加：在F0,F1/F2和F3/F4组中分别升高1.02、1.65和2.96倍,其中：在F0期(肝炎无肝纤维化)无显著变化且无统计学意义；晚期较早期miR-185表达量有所增加且有统计学意义,可推测miR-185可能是肝纤维化累积的一个量化指标;(2)24例中HBV晚期肝纤维化患者外周血中检测miR-185的表达,按照病毒载量高低进行分析,发现miR-185在不同病毒载量下的表达无显著变化,P=0.9768,即miR-185在外周血中的表达与HBV感染及病毒载量的高低无关；(3)miR-185诊断早期肝纤维化的ROC曲线下面积为0.8583(95%CI：0.7274-0.9726),敏感度75%,特异度95.24%,P=0.0001276,可作为早期肝纤维化的诊断指标；(4)miR-185诊断晚期肝纤维化的ROC曲线下面积为0.9395(95%C10.8725-1.006),敏感度87.5%,特异95.24%,P<0.0001,可作为晚期肝纤维化的诊断指标；(5)晚期较早期miR-185表达量有所增加且有统计学意义,可作为鉴别早期和晚期肝纤维化的诊断指标。结论：miR-185在HBV感染患者的外周血中随肝纤维化进展其表达量显著增加,且表达量与HBV感染及病毒载量的高低无关,可通过测定外周血miR-185的浓度来判定肝纤维化量的多少,尤其在肝纤维化早期进行定性定量监测,代替目前临床难以进展的肝穿刺活检,为肝纤维化早期检测和治疗提供新的依据和方法。