论文部分内容阅读
随着社会经济的加速发展,心血管疾病在我国发病率逐年升高。心血管疾病的发生和发展是多种危险因素协同作用的结果,砷是环境中广泛存在的有毒类金属之一,通过氧化应激引起心肌损伤,而p66Shc蛋白在细胞氧化应激中有重要作用。本研究探讨了 p66Shc在亚砷酸钠介导的心肌细胞氧化应激中的作用。本研究中,用CCK-8比色法检测细胞活力发现随亚砷酸钠处理浓度的升高(0、5、10、15μM),心肌细胞活力呈剂量依赖性降低。用Hoechst33258染料检测细胞凋亡小体,发现心肌细胞随亚砷酸钠处理浓度的升高凋亡率呈剂量依赖性升高。双氯荧光素探针检测发现心肌细胞内ROS水平随亚砷酸钠处理浓度的升高呈剂量依赖性升高。研究提示亚砷酸钠可能通过氧化损伤诱导心肌细胞活力降低,凋亡率升高。氧化应激信号通过p66Shc发生磷酸化等一系列生理过程,调控其从胞浆转位至线粒体和细胞核,促进ROS的发生。我们用5μM亚砷酸钠处理心肌细胞后,Western蛋白免疫印迹法检测发现p66Shc表达量和丝氨酸36位磷酸化p66Shc水平显著性增加,磷酸化p66Shc与总p66Shc的比值也显著性升高。亚砷酸钠处理心肌细胞后,通过免疫荧光染色p66Shc,并用Mito Tracker标记线粒体以及DAPI复染细胞核,进行免疫荧光共聚焦检测,结果表明细胞内p66Shc荧光信号明显升高,部分p66Shc从细胞浆转位到线粒体,部分p66Shc进入细胞核。这些结果表明亚砷酸钠上调心肌细胞内p66Shc的表达和磷酸化水平,改变p66Shc在胞内的亚细胞分布定位。为了进一步确认p66Shc在亚砷酸钠诱导的氧化应激的作用,进行了 siRNA敲低和过表达实验。利用p66Shc特异性敲低siRNA(si-p66Shc)转染心肌细胞,Western检测显示,与对照组相比,转染si-p66Shc特异性降低p66Shc蛋白表达。DCFH-DA检测表明,当敲低心肌细胞内的p66Shc时,亚砷酸钠引起的ROS水平与对照组相比显著降低。构建p66Shc野生型和突变型p66ShcSer36Ala真核表达质粒,分别转染心肌细胞后进行亚砷酸钠处理,结果发现与对照组相比,过表达野生型p66Shc质粒显著增加亚砷酸钠引起的胞内ROS水平升高,而过表达突变型p66shcSer36Ala质粒显著降低胞内ROS水平。这些结果表明p66Shc介导亚砷酸钠诱导的心肌细胞ROS水平的升高。p66Shc通过直接转位至细胞核内与转录因子FOX03a相互作用,也可以通过AKT磷酸化FOX03a促进其磷酸化,抑制转录活性,从而抑制相关抗氧化酶基因的表达,增加细胞内的活性氧水平。我们进一步检测了 AKT和FOX03a的磷酸化水平,结果表明亚砷酸钠处理后,AKT第473位丝氨酸发生磷酸化,磷酸化AKT与总AKT的比值显著性升高;同时FOX03a第253位丝氨酸磷酸化水平也增加。这些结果提示亚砷酸钠可能通过p66Shc转位至细胞核以及磷酸化AKT两种途径磷酸化FOX03a,抑制抗氧化酶基因的表达。综上所述,亚砷酸钠通过上调心肌细胞p66Shc表达和磷酸化,引起p66Shc从细胞浆转位至线粒体,诱导细胞内ROS水平的增加;同时,亚砷酸钠可能通过p66shc磷酸化FOX03a抑制抗氧化酶基因的表达,导致胞内氧化还原失衡引起ROS水平升高。