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巨噬细胞侵染增强因子Mip(macrophage infectivity potentiator,Mip)是人的病原细菌嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)中的重要致病因子,它属于FKBP类型的肽基脯氨酰基顺反异构酶(peptidylprolyl cis-trans isomerase,PPIase)(FKBPs)。Mip或Mip-like蛋白也是其它一些人或动物病原生物如Q热立克次体(Coxiella burnetii)和沙门伤寒氏菌(S.typhimurium)的致病因子。在植物病原细菌中,只有木质部难养细菌(Xylella fastidiosa)基因组中注释了一个名为mip-like的基因,至于mip-like在其它植物病原细菌中是否存在以及其生物学功能未见报道。本研究中,我们用木质部难养细菌的Mip-like蛋白的氨基酸序列去搜索野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)(该菌是引起十字花科植物黑腐病的病原菌)8004菌株的基因组,发现基因XC2699(原来注释为肽基脯氨酰基顺反异构酶)与木质部难养细菌的mip-like基因和嗜肺军团菌的mip基因在氨基酸水平上分别有85%和49%的相似性。为此,我们将XC2699重新命名为mip-like。 为了确定ORF2699编码的产物是否是一个肽基脯氨酰基顺反异构酶以及其类型,我们将该ORF2699的编码区序列克隆到载体pET-30上并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行过量表达,然后将带有六组氨酸标记的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的Mip—like融合蛋白纯化,并用蛋白酶偶联法,以N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide为底物测定了该蛋白的PPIase酶活性,结果证实纯化后的目标蛋白具有肽基脯氨酰基顺反异构酶活性;其Km和Kcat值分别为21.72mM和7.2×104S-1,Kcat/Km为3.29×106M-1S-1。酶活性抑制特性测定结果表明,其活性能被免疫抑制药物FK506特异抑制而不受另一种免疫抑制药物环孢菌素A(clycosporin A)抑制。这些结果证明XC2699是一个mip-like基因,Xcc Mip-like蛋白是一个FKBP类肽基脯氨酰基顺反异构酶。 为了确定Mip-like蛋白在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中的生物学功能,我们利用自杀质粒pK18mob整合突变方法构建了mip-like基因的非极性突变体,并在寄主植物满身红萝卜(Raphanus sativus L.var.radiculus Pers.)上用剪叶法测定了其致病性,结果发现,接种十天后,接种mip-like突变体NK2699的叶片的平均病斑长度为2.3mm,而接种野生型菌株8004的叶片的平均病斑长度为15.1mm,而且突变体致病性的降低能被一个野生型的mip-like基因反式互补(接种互补菌株CNK2699的叶片的平均病斑长度为13.6mm)。这一结果证明mip-like基因是Xcc致病所需要的。为了了解mip-like基因影响致病的机制,我们进一步检测了该突变体在培养基上的生长情况以及致病因子产生情况,结果发现(ⅰ)mip-like突变体NK2699在NYGA培养基上的生长与野生型菌株8004基本一致;但在基本培养基上该突变体的生长非常差,而野生型菌株和互补菌株生长良好;(ⅱ)mip-like突