鱼精蛋白对细菌及生物膜的抑制作用及初步应用研究

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鱼精蛋白(Protamine)作为一种从鱼类精巢中提取的天然蛋白质,毒理学实验证明其无毒、无害、无副作用,具有较好的抑菌活性,在医药及食品领域有潜在应用前景。在食品领域,鱼糜及其制品是有效利用新鲜鱼的有利途径,但由于水分含量高、营养丰富而易被微生物污染,从而腐败变质。目前多采用添加化学防腐剂来保鲜鱼糜制品,存在可能的安全隐患和对品质的不良影响,选用天然物质作为食品防腐剂,同时又能改善其品质引起了人们的关注。本文以鱼精蛋白为研究对象,研究其抑菌特性、对细菌生物膜的作用效果及在鱼糜及鱼糕的应用,为鱼精蛋白的实际应用提供理论依据。本论文得到以下结果:1.通过鱼精蛋白的抑菌试验,分析鱼精蛋白对食品中4种常见病原菌-金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)和沙门氏菌(Salmonella enterica)的最低抑菌浓度、抑菌速率及食品成分对其抑菌活性的影响。结果表明:鱼精蛋白对不同菌种的抑菌效果差别较大,对革兰氏阳性菌-金黄色葡萄球菌和李斯特菌的抑制效果优于革兰氏阴性菌-大肠杆菌和沙门氏菌。其中,鱼精蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好,最低抑菌浓度为125×10-6g/mL,但当鱼精蛋白作用于青霉素耐药型金黄色葡萄球菌时,抑菌活性下降,最低抑菌浓度为500×10-6g/mL;当鱼精蛋白的浓度为最低抑菌浓度时,对金黄色葡萄球菌的抑菌动态曲线趋势始终平缓,表明鱼精蛋白能在较短时间内抑制细菌的生长,处理4分钟,抑菌率达100%且效果持久;鱼精蛋白浓度为250×10-6g/mL时,食品中的葡萄糖、蔗糖、脂肪及氯化钠对其抑菌活性几乎无影响,浓度降低至125×10-6g/mL即最低抑菌浓度时,食品中的糖类(包括葡萄糖和蔗糖)、氯化钠及脂肪在一定程度上降低了鱼精蛋白的抑菌活性,且抑菌率随这些成分浓度的增大而降低,5%的葡萄糖、5%的蔗糖、1.5%的脂肪分别使鱼精蛋白的抑菌率下降了36.8%、34.3%、38.5%,而加入氯化钠后鱼精蛋白的抑菌活性也有所下降且促进了细菌聚集成团。2.以金黄色葡萄球菌为试验菌种,探讨金黄色葡萄球菌在不同环境体系中的成膜能力,建立其成膜动态模型,并在成膜前或成膜期间加入不同浓度的鱼精蛋白研究鱼精蛋白对细菌生物膜形成的影响。结果表明:金黄色葡萄球菌在37℃下,培养一段时间后可在酶标板、试管内壁(培养基中含葡萄糖)及玻片上形成细菌生物膜,其形成能力与菌株类型、通氧量及培养基成分相关,青霉素耐药性金黄色葡萄球菌比普通菌成膜能力更强、在氧气充足时更易形成生物膜、葡萄糖的加入促进细菌生物膜的形成;在细菌生物膜形成前,加入鱼精蛋白,可较好地抑制细菌生物膜的形成;在金黄色葡萄球菌形成细菌生物膜后,添加鱼精蛋白,对生物膜中活菌的抑制效果相对较差,将附有已成膜24h生物膜的玻片置于含鱼精蛋白的LB液体培养基中,其中鱼精蛋白浓度为5.00×10-4g/mL,继续培养24h后,测得仍有5.23LgCFU/mL活菌存在,将此浓度的鱼精蛋白与乙二胺四乙酸二钠复合后,可增加鱼精蛋白对细菌生物膜中活菌的杀菌效果,此时活菌数减少为3.94LgCFU/mL。3.以鱼糜及鱼糕为对象,通过向其加入不同浓度的鱼精蛋白,研究鱼精蛋白对鱼糜及鱼糕的保鲜效果,得到了以下结论:将0.0187%、0.0375%、0.075%(质量比)的鱼精蛋白分别加入到鱼糜中时,分别能将新鲜鱼糜的保质期延长2天、2天和2天以上,但保质期仍较短,需要对鱼糜进行表面杀菌处理或增加鱼精蛋白浓度;鱼精蛋白延长了鱼糕的货架期,未添加鱼精蛋白的鱼糕在第6天即已变质,添加了0.075%、0.15%鱼精蛋白的鱼糕在第12天仍未变质,鱼精蛋白对鱼糕中的葡萄球菌的抑制效果尤为显著,添加0.15%鱼精蛋白的鱼糕在4℃下保存12天后仍无葡萄球菌生长;添加鱼精蛋白的鱼糕的pH值上升相对较平缓,腐败变质变缓,4℃下保存12天后,空白对照组鱼糕的pH上升了0.77,而加0.15%鱼精蛋白的鱼糕的pH仅上升了0.43;将0.0375%、0.075%、0.15%的鱼精蛋白加入鱼糕时,改善了鱼糕的弹性及色度,其中加入0.075%鱼精蛋白后的鱼糕弹性最大,比对照组鱼糕弹性增加了0.085,0.15%鱼精蛋白后的鱼糕色度值最高,比对照组的色度值高3.36;鱼精蛋白使鱼糕的初始持水能力下降,但在第6天时,添加了0.075%鱼精蛋白的鱼糕的持水能力高于对照组鱼糕的持水能力;鱼糕中的细菌即使在冷藏的条件下,仍然有形成细菌生物膜的能力,加入了鱼精蛋白的鱼糕中细菌形成生物膜的能力大大降低。
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