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研究目的:耐药是当前多发性骨髓瘤（MM）临床治疗的最主要难题,但由于其确切的机制不明,迄今仍缺乏有效的干预手段。Mcl-1是Bcl-2家族抗凋亡蛋白之一,其过表达与MM发生发展及耐药密切相关。Mcl-1属于一种快速代谢的短寿命蛋白,其半衰期约2-3小时,因其周转快,故维持其细胞内高水平以保证MM细胞生存,有赖于基因转录机制的持续活化。细胞内基因转录受P-TEFb（CDK9/cyclin T1/2复合体）调控,其通过磷酸化RNA-Pol II的C末端（CTD）,激活该酶启动转录并介导转录延伸。在多种肿瘤（包括MM）细胞中,P-TEFb复合体不同亚基及其负性调节因子常见基因突变或表达异常,导致基因转录的持续激活,以维持肿瘤细胞的生存和快速增殖,并抵抗环境应激（包括化疗、放疗等）,故肿瘤细胞被认为具有转录依赖性（或称转录成瘾性）。本课题通过对P-TEFb复合体及其负性调控因子的研究,探讨了P-TEFb复合体介导的转录依赖对MM发生、发展（特别是耐药）的影响,并提出了通过靶向P-TEFb转录调控Mcl-1表达或直接靶向Mcl-1蛋白抗凋亡功能、联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Bortezomib,Btz;MM一线治疗药物）或Bcl-2抑制剂维奈托克（Venetoclax,又称ABT-199;已获批用于血液肿瘤治疗）的双靶点干预策略（dual-targeted therapy,DTT）,以克服MM耐药。研究方法:1.利用R2:Genomics Analysis and Visualization Platform平台,通过MM转录组学数据库,分析MM患者中目的基因的表达水平,包括组成P-TEFb复合体相关基因CDK9和CCNT1/2（编码cyclin T1/T2）及其负调节基因HEXIM1/2等;KEGG分析目的基因相关的信号通路和功能;Kaplan–Meier曲线分析CDK9、CCNT1/2、HEXIM1/2等基因的表达水平与总生存率（OS）的相关性。2.RNA-seq和Western blot验证CDK9和cyclin T1/2及负调节因子（如HEXIM1/2等）在MM患者临床样本中的表达情况;sh RNA敲低实验分析CDK9和cyclin T1对RNA Pol II活性及Mcl-1表达的影响;免疫共沉淀实验分析CDK抑制剂Dinaciclib（又称SCH727965）等靶向P-TEFb（CDK9/cyclin T1复合体）的作用机制,及其对下游Mcl-1表达的影响。3.Western blot和流式细胞术分析CDK9特异性抑制剂Bay-1143572（Atuveciclib）通过抑制Mcl-1转录对不同MM细胞系（包括Btz耐药细胞系）的杀伤作用及其机制;应用荷瘤小鼠动物模型及小动物成像系统、免疫组化、Western blot实验等验证已进入临床试验的CDK抑制剂对MM细胞移植瘤的体内作用及其机制。4.流式细胞术分析CDK9抑制剂Bay-1143572联合Bcl-2抑制剂ABT199的抗MM作用;Western blot分析并验证两种抑制剂的协同机制;通过荷瘤小鼠模型及小动物成像系统验证两种抑制剂联合治疗对小鼠生存的影响;流式细胞术和Western blot分析CDK9抑制剂Bay-1143572与Btz联合应用的协同作用及其分子机制。5.RNA-seq分析Bcl-2凋亡蛋白家族成员相关基因MCL1、BCL2、BCL2L1（编码Bim）等在MM患者临床样本中的表达情况;流式细胞术分析Mcl-1抑制剂S63845对不同MM细胞系的杀伤作用;通过Western blot和免疫共沉淀实验分析S63845联合Btz的协同作用及其分子机制。6.Western blot分析比较Mcl-1、Bcl-2、Bim等在不同MM细胞系中的表达情况;流式细胞术、Western blot和免疫共沉淀检测Mcl-1抑制剂S63845联合ABT-199对MM细胞的杀伤作用及其机制。7.选择GEO数据库中RRMM患者骨髓CD138+细胞单细胞测序数据集（GSE161801）,通过与健康供者比较,排除正常细胞,并排除NK细胞、单核细胞等细胞成分,获得MM细胞,进而对其进行分亚群;基于这些亚群,分析转录机制相关基因差异表达,获得存在转录机制异常的亚群,GO分析发现RNA Pol II通路异常亚群,进一步GO分析其相关功能;基于每个亚群Top 5转录机制相关差异表达基因,比较其在不同亚群中表达的情况。研究结果:1.转录组分析基因表达谱（GEP）发现,在意义未明单克隆免疫球蛋白血症（MGUS）和冒烟型骨髓瘤（SMM）向MM发生过程中,CDK9和CCNT1/2表达逐步升高,而HEXIM1/2表达则逐渐下降;与正常供者相比,初诊MM（NDMM）和复发难治MM（RRMM）患者中CDK9表达显著上调,而HEXIM1则下调;CDK9和CCNT1表达水平越高,MM患者的总生存期越短,呈正相关;相反,HEXIM1/2的表达则与患者的总生存期短（预后不良）呈负相关。KEGG分析显示,CDK9表达相关基因富集的主要信号通路包括spliceosome、OXPHOS、proteasome、RNA polymerase、DNA replication等,与CCNT1相似,与CCNT2则明显不同,而与HEXIM1/2则相反。提示MM细胞中CDK9和cyclin T1可能是构成P-TEFb的主要成分,而HEXIM1可能是其主要的负调节因子。RNA-seq分析显示,在MM患者临床样本中,CDK9表达显著上调,CCNT1在多数患者中上调,而HEXIM1则在部分患者中下调。进一步证实了上述推测。2.在MM细胞中,敲减CCNT1（编码cyclin T1）后,磷酸化CTD（p-CTD）和Mcl-1表达下调,但不显著影响CDK9表达;敲减CDK9后,不仅p-CTD和Mcl-1表达下调,且cyclin T1明显下调,提示与CDK9结合可能增加cyclin T1蛋白稳定性;CDK抑制剂Dinaciclib显著抑制p-CTD并下调Mcl-1,但不影响CDK9蛋白水平及磷酸化;免疫共沉淀发现,Dinaciclib处理明显减少CDK9与cyclin T1的结合,但增加CDK9或cyclin T1与HEXIM1的结合,提示Dinaciclib可能通过P-TEFb解聚而抑制其活性。3.CDK9特异性抑制剂Bay-1143572剂量依赖性抑制p-CTD并下调Mcl-1表达,诱导MM敏感细胞株（U266）及其Btz耐药细胞株（PS-R）凋亡,伴PARP剪切增加;与此相同,多种已进入临床试验的CDK抑制剂Dinaciclib、Flavopiridol（又称Alvocidib）和Seliciclib均能通过抑制p-CTD和Mcl-1表达,显著诱导MM细胞凋亡;在皮下移植瘤小鼠模型中,CDK抑制剂处理能显著抑制肿瘤生长,并与抑制p-CTD和下调Mcl-1有关;在经尾静脉注射MM细胞建立的骨髓归巢小鼠模型中,CDK抑制剂处理明显抑制肿瘤生长,免疫组化染色证实药物干预组小鼠骨髓切片中CD138阳性MM细胞显著减少。提示CDK抑制剂或特异性CDK9抑制剂,靶向P-TEFb,通过下调Mcl-1,发挥抗MM作用。4.CDK9抑制剂Bay-1143572和ABT199联合应用,显著提高对MM细胞（包括Btz耐药株）的杀伤作用;Bay-1143572处理阻断ABT199介导的Mcl-1上调,促进细胞凋亡;C57BL/Ka Lw Rij小鼠尾静脉注射5TGM1细胞建立的模型中,CDK抑制剂和ABT199联合治疗,明显降低肿瘤负荷,并延长动物生存;与此相似,Bay-1143572与Btz联合,也表现出显著的协同作用,并抑制p-CTD和Mcl-1的表达。5.RNA-seq分析MM患者临床样本显示,Bcl-2家族成员抗凋亡基因（MCL1和BCL2）呈显著高表达,而促凋亡基因BCL2L1则呈低表达,提示MM细胞对Mcl-1和Bcl-2的依赖性;Mcl-1抑制剂S63845对MM敏感细胞株（U266）及其耐药株（PS-R）具有杀伤作用,且后者可能更为敏感;与髓内MM细胞株（KMS28-BM）对S63845高度敏感相反,其相应的髓外MM细胞株（KMS28-PB）则对S63845几乎无反应,提示MM髓外病变可能对Mcl-1抑制剂不敏感;进一步研究发现,S63845主要通过阻断Mcl-1和Bim的结合,释放并激活Bim,诱导MM细胞凋亡;与CDK抑制剂相似,S63845和Btz联合应用,对MM敏感细胞株（U266）及其Btz耐药系（PS-R）,均显示出明显的协同作用,显著提高Btz的抗MM作用,并可能克服耐药。6.与MM患者临床样本相符,MM细胞系中抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1呈高表达,而促凋亡蛋白Bim也呈现高水平,提示Bim通过与Mcl-1和Bcl-2结合而失活,但可能使MM细胞处于凋亡待激（priming）状态,对凋亡敏感;MM细胞对Bcl-2抑制剂不敏感,可能与ABT-199抑制Bim与Bcl-2结合,但Bim转而与Mcl-1结合有关;免疫共沉淀和Western blot分析显示,Mcl-1抑制剂S63845则能阻断Bim与Mcl-1结合,可显著促进ABT199诱导的MM细胞凋亡,从而发挥协同抗MM作用。7.RRMM患者骨髓CD138+细胞单细胞转录组分析显示,同一患者中存在多个亚群（亚克隆;n=27）,其差异基因表达各不相同,验证了MM的克隆异质性,其中半数以上亚群存在显著的转录机制相关基因表达异常,但其涉及的转录调控环节有所不同,并发现一个与RNA Pol II通路异常密切相关的亚群,其可能参与内质网应激、蛋白质翻译、B细胞激活等已知与MM生物学紧密相关的功能。因此,提示MM细胞的转录依赖性存在克隆异质性。结论:1.Mcl-1与MM一线药物蛋白酶体抑制剂（如Btz等）获得性耐药密切相关,Mcl-1蛋白半衰期短,故维持其在MM细胞中的高水平有赖于P-TEFb介导的转录机制的持续激活,即转录依赖性（成瘾性）,可能参与MM耐药。2.MM细胞中转录机制的持续激活主要与CDK9和cyclin T1高表达及其相互结合（形成P-TEFb复合体）有关。3.单细胞转录组分析,提出MM细胞转录依赖性存在克隆异质性,并发现一个RNA Pol II通路异常的亚克隆,其可能与内质网应激、蛋白质翻译、B细胞激活等功能有关。4.CDK抑制剂（如Dinaciclib）能使P-TEFb（CKD9与cyclin T1复合体）解离,并促进CDK9或cyclin T1与HEXIM1结合,从而抑制P-TEFb活化,导致Mcl-1表达下调,代表了CDK抑制剂的一种新的作用机制。5.P-TEFb及其下游Mcl-1作为MM的分子靶点,应用泛CDK或CDK9特异性抑制剂靶向P-TEFb下调Mcl-1、或直接靶向Mcl-1蛋白的抗凋亡功能,联合Bcl-2抑制剂ABT-199或Btz,协同诱导MM细胞凋亡,提示双靶点干预策略,能显著增强抗MM作用,并有助于克服MM耐药。