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致病性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,Ah）是我国淡水养殖鱼类的重要病原之一,研究其毒力因子对了解该菌的致病机制具有重要的意义。Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion system,TTSS）与动植物的许多革兰氏阴性病原菌的毒力因子的分泌有关。本研究从嗜水气单胞菌J-1株中克隆出Ⅲ型分泌系统AscV基因,成功构建了其缺失突变株;另外对嗜水气单胞菌的外膜蛋白OMP Ⅱ进行了研究。 根据已发表的嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统AscV基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以嗜水气单胞菌AhJ-1株的基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增出一段大小约为710bp的核苷酸片段。将该片段克隆至质粒载体pMD18-T中,随后进行测序及序列分析。结果表明:扩增出的基因片段与嗜水气单胞菌AH3株Ⅲ型分泌系统中的AscV基因有96%的同源性,与杀鲑气单胞菌的同源性为86%,与温和气单胞菌的同源性为85%。在检测的39株嗜水气单胞菌中,37株致病菌都扩增出目的片段,而另外2株非致病菌没有目的片段扩出,推测AscV基因为致病菌株所特有。 将含有卡那霉素抗性（Kmr）基因的自杀性质粒pJP5603及连入T载体的AscV基因PCR产物用EcoR Ⅰ与Pst Ⅰ双酶切后,回收3.0Kb与713bp的目的片段,连接后转化感受态细胞cc118λpir,利用Kmr进行筛选,获得的克隆经EcoR Ⅰ与Pst Ⅰ双酶切及PCR鉴定,确定得到重组质粒,命名为pYYAscV。将重组质粒转化感受态细菌J-1株,筛选到的克隆经PCR鉴定,得到1个突变株,命名为AhJ-1△AscV。同时研究了该突变株的主要特性,与亲本株相比,其胞外蛋白酶、淀粉酶以及溶血素均检测不到。说明AscV在嗜水气单胞菌J-1株的致病过程中发挥重要作用,这为探讨AscV基因的功能奠定基础。 根据已经发表的外膜蛋白基因porin Ⅱ的核苷酸序列,设计一对特异性引物,以本实验中的18株嗜水气单胞菌的基因组DNA为模板,进行PCR扩增,结果表明,有11株扩增出1008bp的目的片段。用十二烷基肌胺酸钠抽提结合高速离心纯化,制备了18株嗜水气单胞菌的主要外膜蛋白（MOMP）。经SDS-PAGE图谱发现,porin