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目的： 细胞凋亡是导致心肌缺血再灌注损伤的重要发病机制之一，但其确切病理机制尚不完全清楚。目前认为细胞内钙离子浓度的升高是细胞发生凋亡的一个重要条件，尤其是细胞核钙浓度([Ca2+]n)的增高在细胞凋亡的发生发展中发挥关键性作用。最近研究发现，缺血心肌恢复灌注时，伴随着细胞浆钙浓度([Ca2+]C)的升高，[Ca2+]n呈持续性增高；而且，再灌注早期及晚期均存在细胞凋亡的发生。据此，有学者提出细胞核钙超载可能参与了心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡发生发展的病理机制。 鉴于钙跨核膜转运系统是致核钙浓度改变的首要环节，本实验在大鼠心肌缺血再灌注模型基础上，观察心肌细胞核膜IP3R、IP4R对核钙信号转导的调节变化及二者在缺血再灌注时各种病理情况下对核钙信号的转导调节，以探讨心肌缺血再灌注损伤时心肌细胞核钙超载的机理，进一步揭示心肌缺血再灌注损伤时心肌细胞凋亡发生发展的病理机制。 方法： 建立大鼠心肌缺血再灌注动物模型，SD大鼠（雄性，体重350±50g）120只，随机分为缺血再灌注损伤组（心肌缺血30min再灌注3h时，IRI组）及假手术（Sham-operated）组，每组6只。采用甲基四氮唑蓝染色（TTC染色）法、硫代巴比妥酸法、脂肪酸一次提取比色法检测大鼠心肌缺血再灌注时心肌梗死面积、心肌组织及血清MDA、NEFA含量，以评估大鼠心肌缺血再灌注时心肌损伤形态学及氧化损伤程度；原位缺口末端标记（TUNEL技术）检测心肌细胞凋亡率；在蔗糖密度梯度离心法提纯心肌细胞核后，采用放射配基受体分析技术检测心肌缺血再灌注时核膜IP3R、IP4R结合特性变化、二者经磷酸化调节及不同胞浆钙浓度情况下结合特性的改变。 结果： 1．与假手术组比较，大鼠心肌缺血30min再灌注3h时，心肌组织发生显著的氧化损伤、细胞坏死及细胞凋亡，心肌梗死面积为26.3±0.8％；心肌组织MDA、NEFA含量分别显著增加2.46倍、2.55倍（p＜0.01），血清MDA、NEFA含量显著增加1.94第三军医大学硕士学位论文倍、1.21倍（p<0.01）;心肌细胞凋亡率显著增高（p<0.01）。 2.1甩组与假手术组比较，心肌细胞核IP3R的最大结合容量Bmax增加2.6倍（804士230 vs 309士10 fmol/m 9 protein，夕<0.05）;而其亲和力Kd值无明显变化（25.6士3.5vs 22.2士1 .3，P>0.05）。 3.IRI组心肌细胞核IP3R经激活的PKC磷酸化后结合特性增强1.54倍（88.27士13.46vs 2 36.05士12.53 fmol/mg protein，夕<0.05），假手术组核Ip3R经pKC磷酸化后结合特性无明显改变（102.83士10.73 vs 106.24士24.76，尸>o·05）。 4.[Caz+〕对I租组及假手术组心肌细胞核IP3R的调节均呈双相性，胞浆钙超载状态下（[C扩勺为5 oM时）较正常胞浆钙浓度下（民扩勺为100nM时），两组核IP3R结合特性均显著增强，[eaZ+]为1 00只M时，两组核xP3R结合特性降低。 5.大鼠心肌细胞核上存在两个不同结合容量、不同亲和力的IP4结合位点，Hill分析提示两心肌细胞核IP4R均为简单单位点结合受体。 6.IRI组与假手术组比较，心肌细胞核IP4R高亲合位点最大结合容量Bmaxl显著增加1.91倍（20.37士0.01 vs 39.03士0.20 fmol/m gprotein，尸<0.05），但低亲合位点Bmax无显著变化（177.05士10.98 vs 151.11士3.03 fmol/m 9 protein，刀>0.05）;同样，IRI组与假手术组比较，心肌细胞核IP4R高亲合位点Kdl值降低63%（1 .28士0.02 vs 0.48士0.03 nM，尸<0.01），低亲合位点kdZ值降低55%（57.15士15.51 vs 25.75士6.67nM，P<0 .01）。 7.假手术组与IRI组心肌细胞核IP4R经激活的PKC磷酸化后结合特性分别增加3 .74倍（4.037士0.99 vs 15.11士1.29 fmol/mgprotein，夕<0.05）、9.52倍（1.98土0.33vs15.53士2.33加01/m gprotein，夕<0.05），以IRI组增加更显著。 8.正常大鼠心肌细胞核IP4R与[“H」IP4结合特性随着反应体系中游离〔caZ+〕的增加而增强。而在I犯组，【caZ十〕对心肌细胞核IP4R结合调节呈双相性，【caZ十〕为5 pM时核 IP4R结合特性较「c扩十」为loonM时显著增强，此增强倍数高于同种情况下正常组大鼠核IP4R结合特性的增强倍数。 结论: 1.大鼠心肌缺血30min再灌注3h时，心肌组织发生了明显的氧化损伤、细胞坏死及细胞凋亡。 2.大鼠心肌细胞核上存在两个不同结合容量、不同亲和力的IP4结合位点，Hin分析提示两心肌细胞核IP4R均为简单单位点结合受体。 3.大鼠心肌缺血再灌注损伤时，心肌细胞核内膜IP3R受体密度上调，核外膜IP4R第三军医大学硕士学位论文受体密度及与其配体IP;的结合特性也显著增强。再则，胞浆钙超载及PKC激活病理情况下，心肌细胞核IP3R、IP4R结合特性均显著增强。以上结果提示，心肌缺血再灌注时，心肌细胞核核内膜IP3R将钙由核周腔释放入核浆的潜在能力增强，核外膜IP4R摄取胞浆钙入核浆的潜在能力也增强，两者共同作用，致[c扩+」n增高，从而间接介导了心肌缺血再灌注时细胞凋亡的发生发展。