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骨是密布血管的组织。越来越多的证据表明,在骨骼发育及骨受到损伤的再生过程中,血管生成对于骨的形成和修复至关重要。但是,调控骨中血管生成的机制并不完全清楚。转录激活因子4(ATF4)对于机体生命过程中的骨骼发育是必需的,但是ATF4在骨血管生成中的作用却不明确。在本文中,我们运用对比增强型灌注成像技术研究了野生型和Aft4敲除小鼠头盖骨和股骨中的血管生成情况,发现Aft4敲除的小鼠头盖骨和股骨中血管容积和数量显著降低。对小鼠的胫骨切片进行CD31的免疫组织化学染色,发现Aft4敲除的胫骨骨骺部位的外膜和骨干部位的内膜中CD31的阳性面积明显减少,表明血管面积和密度降低。Real-TimePCR结果显示,Aft4敲除的小鼠胫骨中Vegf及其三个异构体Vegf120, Vegf165和Vegf188的mRNA显著下降。免疫组织化学实验表明,Aft4敲除的小鼠中VEGF在骨小梁表面的成骨细胞中以及在骨质中的表达降低。但是,野生型和Aft4敲除小鼠的血清中VEGF的含量并没有变化。体外血管形成实验表明,Aft4敲除的跖骨中内皮细胞从跖骨的长出几近丧失,但当添加重组的VEGF蛋白时,内皮细胞恢复生长。ATF4的缺失影响了HIF-1α在骨小梁表面成骨细胞中的表达,但pVHL的表达没有受到影响。缺氧的情况下,在成骨细胞中过表达ATF4可以上调HIF-1α和VEGF的表达。机制上,ATF4的缺失可以增强HIF-1α的泛素化水平,降低HIF-1α蛋白的稳定性,但对于其mRNA的稳定性和蛋白质的翻译过程却没有影响。此外,在缺氧的条件下,ATF4的缺失增强了HIF-1α与脯氨酸羟基化酶(PHD1, PHD2和PHD3)的结合,增强了其402和564两个脯氨酸位点的羟基化水平,使更多的羟基化的HIF-1α走向蛋白酶体降解,由此降低了HIF-1α的蛋白水平。有意思的是,甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)和RANKL——两个破骨细胞的激活剂,依赖ATF4并通过PKC信号通路促进破骨细胞的分化和骨吸收,使骨质中的VEGF释放,促进血管生成。同时,通过体内实验证明,间歇性缺氧处理小鼠后,野生型小鼠中HIF-1α和VEGF的表达增加,骨血管生成增强(CD31阳性面积增加),但ATF4缺失后,HIF-1α,VEGF以及CD31并没有变化,表明小鼠对缺氧环境的适应机制丧失。综合上述实验,我们证实在成骨细胞缺氧的条件下,ATF4是HIF/VEGF信号通路的主要调节因子,同时ATF4可以调控骨质中的VEGF释放,进而促进骨血管生成。