研究背景随着人民生活饮食结构的变化,人们工作方式的转变,以及社会人口老龄化的进展,糖尿病的患病率正在全球范围内迅速增加。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是最常见的糖尿病微血管并发症之一,也是造成终末期肾脏病的主要原因,给糖尿病患者带来极大的精神负担和经济负担。尽管近年来有关DN的基础和临床研究层出不穷,但迄今为止,针对DN的有效治疗方式却比较局限。目前,DN的临床处理手段主要有戒烟、严格控制血糖、血脂及应用ACEI抑制剂等。上述手段虽然能降低DN的发生风险,降低微量蛋白尿和蛋白尿的发生,延缓DN的进程,但是并不能完全阻断DN的疾病进展。另外,要求糖尿病患者严格控制血糖并长期达标并非易事。因此,我们迫切需要进一步理解与阐明DN的发病机制,寻求更有效安全的药物综合诊治糖尿病,阻止或延缓糖尿病肾脏损害的发生与进展。随着近年来国内外众多学者对DN病理机制的深入理解,高血糖所诱发的氧化应激被认为是导致糖尿病慢性血管病变的早期事件及共同机制。过度的氧化应激激活一系列有害的生物过程,比如增加晚期糖基化终末产物的生成(advanced glycation end products, AGEs),激活多元醇途径,激活蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)-细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase, ERK)途径、诱导各种生长因子和细胞因子的表达,引起糖尿病肾脏的组织病理改变。因此,研发有效的抗氧化药物,阻断ROS的继发损害,是延缓及阻止DN进展的重要思路。葡萄籽原花青素提取物(grape seed proanthocyanidin extract, GSPE)是从葡萄籽中提取的一种天然多酚类化合物,具有极强的抗氧化,抗炎,抗凋亡及抗肿瘤等作用。本课题组的前期实验证实,GSPE对STZ诱导的1型糖尿病大鼠主动脉、肾脏、视网膜等靶器官具有明确的保护作用。葡萄籽原花青素B2 (grape seed proanthocyanidin B2, GSPB2)是GSPE中活性最强的二聚体。文献报道,GSPB2具有更为强大的抗炎,抗凋亡,抗动脉粥样硬化等作用。但是,GSPB2对2型糖尿病肾脏损害是否具有保护作用及其发挥药理作用的分子机制尚未见报道。蛋白质是机体生理功能的执行者,也是生命现象的直接体现者。因此,对蛋白质结构和功能的研究将有助于阐明在生理或病理条件下生命活动的变化机制。由于蛋白质在执行生理功能时的表现是多样的、动态的,因此,我们必须从整体上动态地研究蛋白质的变化,才能深刻理解复杂的生命活动。为了宏观而全面地得到一个基因组蛋白质在病理和生理不同状态下差异表达的情况,科研人员将同位素标记的相对和绝对定量技术(isobaric tag for relative and absolute quantitation, iTRAQ)和质谱分析结合起来,实现对一个基因组表达的全部蛋白质进行精确定量和鉴定。但是,蛋白质组学技术对成百上千的蛋白质的鉴定只是对蛋白质功能研究的初始阶段,对大量的差异蛋白进行数据分析和筛选,并借助于基因敲除技术或基因沉默技术深入研究蛋白质的相互作用机制及在疾病发生发展中的作用才是蛋白组学研究的核心内容。基因沉默技术是人为地干扰生物体特定基因的表达或转录,使之不表达。RNA干扰(RNAi)技术通过将双链RNA导入细胞,启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制,从而可以特异性剔除或关闭特定基因的表达。目前,RNAi已被广泛应用于基因功能、信号转导和基因治疗等研究中。本实验第一部分采用国际上公认的2型糖尿病肾病动物模型----db/db小鼠进行GSPB2灌胃治疗,治疗结束后观察肾脏的功能和病理组织的改变,并借助于iTRAQ蛋白质组学技术定性定量分析GSPB2治疗前后的肾脏差异蛋白表达情况。第二部分研究中并利用慢病毒介导的RNAi技术和体外注射重组蛋白对经iTRAQ蛋白质组学技术鉴定出的差异蛋白MFG-E8进行基因沉默和过表达干预,深入探讨MFG-E8在DN疾病进展中的作用及GSPB2对2型糖尿病肾脏损伤保护作用的分子机制和潜在的药物作用靶点。研究目的1.观察db/db小鼠早期肾脏功能改变和组织病理改变的特点,观察GSPB2干预是否改善db/db小鼠肾功能、肾脏组织病理和超微结构。2.应用iTRAQ蛋白质组学技术鉴定db/db小鼠与正常小鼠、db/db小鼠GSPB2治疗组与非治疗组肾脏差异表达的蛋白质,筛选出潜在的药物作用靶点。3.对经iTRAQ蛋白质组学技术鉴定出的差异蛋白质MFG-E8进行功能研究。构建MFG-E8慢病毒干扰载体,注射重组蛋白MFG-E8,观察抑制和升高db/db小鼠肾脏MFG-E8的蛋白表达后对肾脏组织病理及ERK.Akt.GSK-3β信号通路蛋白磷酸化的改变,深入研究MFG-E8在糖尿病肾脏损伤中的作用及可能的分子机制,GSPB2对糖尿病肾脏起保护的分子机制。研究方法7周龄雄性C57BLKS/J db/db小鼠16只及7周龄雄性C57BLKS/J db/m小鼠8只,适应性饲养1周。实验开始后,C57BLKS/J db/m小鼠8只作为正常对照组(CC),C57BLKS/J db/db小鼠随机分为两组：8只作为DM模型组(DM),每日予生理盐水灌胃；8只为GSPB2干预组(DMT),GSPB2溶于与DM组相同体积生理盐水,以30 mg/kg/d灌胃10周。所有小鼠在试验期间未接受任何降糖治疗。每周测小鼠体重。实验结束时,收集小鼠24小时尿液采用ELISA法测定24h尿白蛋白排泄量。实验结束后,小鼠禁食12h后处死,采血测定空腹血糖(FBG).AGEs.BUN和Cr等指标；留取各组小鼠肾脏分别进行HE和PAS染色,观察病理变化；应用透射电镜观察肾小球的超微结构变化。部分肾脏用于iTRAQ蛋白质组学分析和Western blot分析。蛋白质组学(iTRAQ)分析、蛋白质定位分析、功能分析及相互作用网络分析：分别选取CC组、DM组和DMT组小鼠各4只,提取肾脏总蛋白,用trypsin进行蛋白消化得到肽段。用iTRAQ试剂标记消化后的肽段,114标记CC组,115标记DMT组,117标记DM组。将标记的肽段混合后运用强阳离子交换柱(strong cation exchange,scx)和C18柱进行分级分离,酶解产物经毛细管高效液相色谱脱盐及分离后用LTQ VELOS质谱仪(Thermo Finnigan,San Jose,CA)进行质谱分析。原始文件(raw file)用iTRAQ Result Multiple File Distiller分析定量数据,并用Sequest软件鉴定多肽分子。最后,使用Identified iTRAQ Statistic Builder软件将定量及鉴定结果进行合并处理,得到定量和鉴定结果。定量方法采用Identified iTRAQ Statistic Builder软件分析,采用软件计算的ratio biweight值作为蛋白质定量结果,以114标记为内参。搜索使用的数据库为ipi.MOUSE.v3.72.REVERSED.fasta蛋白库Sequest结果过滤参数为：FDR<0.01。采用GO分类(http://www.geneontology.org, VERSION 1.8)工具,从生物学途径、细胞组件及分子功能三方面对鉴定出的肾脏差异表达蛋白质进行功能分析及分类。应用Ingenuity Pathways Analysis (IPA)软件进行生物信息学分析。构建针对小鼠MFG-E8基因靶点的慢病毒干扰载体,并构建含GFP的载体作为对照载体,干扰db/db小鼠MFG-E8基因的表达。7周龄雄性C57BLKS/J db/db小鼠32只及7周龄雄性C57BLKS/J db/m小鼠8只,适应性饲养1周。实验开始后,C57BLKS/J db/m小鼠8只作为正常对照组(CC), C57BLKS/J db/db小鼠随机分为四组：8只DM模型组(DM)；8只为GFP干预组(LV-GFP),于小鼠14周给予GFP尾静脉注射一次；8只为MFG-E8慢病毒干扰载体干预组(MRNAi),于小鼠14周给予LV-MFG-E8尾静脉注射一次；8只为重组MFG-E8蛋白干预组(reMFG-E8),从小鼠14周开始,每周两次尾静脉注射MFG-E8重组蛋白(20μg/kg),共4周。实验周期结束后,所有小鼠禁食12h后处死,迅速摘取肾脏,多聚甲醛或戊二醛固定,HE和PAS染色观察肾脏病理变化；应用透射电镜观察肾脏组织超微结构变化。部分肾脏组织分离后立即投入液氮,然后-80℃保存。Western blot检测各组db/db小鼠肾脏MFG-E8和p-ERK1/2、p-Akt、 p-GSK-3p蛋白表达情况。研究结果1.一般观察：与正常组小鼠相比,db/db小鼠污秽无泽,精神萎靡,明显肥胖,多尿、多饮,体重增加迅速。GSPB2治疗组糖尿病小鼠上述表现减轻,精神状况良好,糖尿病小鼠的体重于GSPB2治疗2周后开始降低(p<0.05)。2. GSPB2 对 db/db小鼠血FBG、AGEs、BUN、Cr和24h尿白蛋白排泄量的影响实验结束时,DM组小鼠FBG、AGEs水平显著高于CC组小鼠,GSPB2治疗后显著降低AGEs水平,但是对FBG无明显影响。实验结束时,DM小鼠BUN、Cr、24h尿白蛋白排泄量显著高于CC正常对照组(p<0.05)；GSPB2治疗后,糖尿病小鼠BUN、Cr、24h尿白蛋白排泄量均显著降低(p<0.05)。说明GSPB2 30mg/kg/day灌胃10周显著降低db/db小鼠体内AGEs水平,显著改善db/db小鼠恶化的肾功能。3. GSPB2对db/db小鼠肾脏组织形态学和超微结构的影响HE和PAS染色观察：与正常组小鼠相比,db/db小鼠肾小球肥大,系膜扩张,系膜基质聚集,系膜细胞增生,肾小囊上皮增生；GSPB2治疗后,db/db小鼠肾小球肥大、系膜扩张和系膜细胞增生显著改善。电镜下超微结构观察：正常组小鼠肾小球基底膜无增厚,足突排列规则,裂孔无融合；db/db小鼠肾小球基底膜不规则增厚,可见钉状突起,足突排列紊乱,并可见大量足突融合；GSPB2治疗后上述改变明显改善。4. db/db小鼠肾脏iTRAQ蛋白质组学分析结果本研究共鉴定出有定量信息的肾脏蛋白2842个。CC组和DM组小鼠肾脏差异表达蛋白671个,其中在DM组小鼠肾脏组织中表达量升高的蛋白质有313个,表达量降低的蛋白质有358个。db/db小鼠肾脏经GSPB2治疗后回调比例>1.5的差异蛋白质113个,其中53个蛋白质表达降低,60个蛋白质表达回升。差异表达蛋白质定位分析显示：胞核蛋白占22%,胞浆蛋白和胞膜蛋白分别占19%和14%,另外还有线粒体蛋白(12%),分泌蛋白(9%),核糖体蛋白(4%),高尔基体蛋白(4%)、内质网蛋白(3%),细胞骨架蛋白(3%),和溶酶体蛋白(1.2%)。差异表达蛋白功能主要包括氨基酸转运和代谢蛋白(19%),结合蛋白(16%)、凋亡和细胞周期蛋白(14%),信号转导蛋白(11%),氧化应激和ATP合成蛋白(7%),核苷酸的转运和代谢蛋白(7%),细胞骨架蛋白(4%),翻译、核糖体结构蛋白(7%),脂质转运和代谢蛋白(6%),分泌蛋白(6%)等。其中肾脏MFG-E8蛋白表达在DM/CC中的比值为2.23,GSPB2治疗后DMT/DM的比值为0.47。应用IPA软件将差异表达蛋白质进行PATHWAY分析,绘制出包括细胞凋亡、氧化应激和脂质代谢等通路,其中MFG-E8包含在细胞凋亡通路中,并和ERK1/2和AKT信号通路蛋白相相关。5. GSPB2、MFG-E8 RNAi和重组蛋白reMFG-E8对db/db小鼠肾脏MFG-E8蛋白表达的影响Western blot分析表明,与正常组小鼠相比,db/db小鼠肾脏MFG-E8蛋白表达明显增高,GSPB2显著抑制MFG-E8蛋白的表达,与iTRAQ蛋白组学分析结果一致。与CC组小鼠比较,DM组和LV-GFP组db/db小鼠肾脏组织MFG-E8的蛋白表达水平明显升高(p<0.05),DM组和LV-GFP组两组之间的MFG-E8蛋白表达无明显差异；MFG-E8 RNAi干扰组db/db小鼠肾脏MFG-E8表达较DM组和LV-GFP组明显降低(p<0.05),约降低60%,说明慢病毒介导的MFG-E8 RNAi干扰效率可达60%；而重组蛋白reMFG-E8组db/db小鼠肾脏MFG-E8的蛋白表达较DM组和LV-GFP组明显升高(p<0.01)。6. MFG-E8RNAi和重组蛋白reMFG-E8对db/db小鼠肾脏组织形态学和超微结构的影响HE和PAS染色观察到,与正常组小鼠相比,DM组和LV-GFP组db/db小鼠肾小球肥大,系膜基质聚集,系膜细胞明显增生,肾小囊上皮细胞增生；MRNAi干扰组db/db小鼠肾小球肥大、系膜扩张、系膜细胞增生显著改善,而重组蛋白reMFG-E8组db/db小鼠肾小球系膜细胞重度增生、系膜基质大量聚集,可见大量炎性细胞聚集,病变较DM组更严重。电镜下超微结构显示,正常组小鼠肾小球基底膜无增厚,足突排列规则,裂孔无融合；DM组和LV-GFP组db/db小鼠肾小球基底膜不规则增厚,足突排列紊乱并大量融合,足细胞内细胞器大量丢失；MRNAi干扰组小鼠基底膜厚度基本正常,基底膜三层结构明显,细胞器结构正常；reMFG-E8组的db/db小鼠肾小球基底膜明显增厚,可见大量铆钉样突起,足突排量紊乱,并大量融合,内皮裂孔减少。组织病理结果说明MFG-E8在db/db小鼠肾脏损害中起促进作用。7. GSPB2、MFG-E8 RNAi和重组蛋白reMFG-E8对db/db小鼠肾脏p-ERK1/2、 p-Akt、p-GSK-3β蛋白表达的影响Western blot分析表明,与正常组小鼠相比,DM组和LV-GFP组肾脏组织p-ERK1/2、p-Akt、p-GSK-3β的蛋白表达水平明显升高(p<0.05)；GSPB2治疗后显著抑制上述蛋白的表达水平(p<0.05)；MRNAi干扰组的p-ERK1/2、 p-Akt、p-GSK-3β蛋白表达较DM组和LV-GFP组明显降低(p<0.05)；而重组蛋白reMFG-E8组上述蛋白表达较DM组和LV-GFP组明显升高(p<0.05)。ERK1/2、 Akt和GSK-3β的总蛋白表达水平各组间无明显差异。结论1. GSPB2 30mg/kg/day灌胃10周显著改善db/db小鼠一般情况,抑制db/db小鼠体重增加；显著降低db/db小鼠血AGEs水平,具有抗非酶糖基化作用；显著降低db/db小鼠血BUN、Cr.24小时尿白蛋白排泄量,改善糖尿病肾病肾功能损害。GSPB2显著抑制db/db小鼠肾小球肥大、系膜区扩张、基底膜增厚,显著改善糖尿病状态下肾脏组织病理损害。2. iTRAQ蛋白质组学技术鉴定出671个db/db小鼠肾脏差异表达的蛋白,其中113个经GSPB2治疗后回调。这些差异蛋白以胞浆蛋白为主,通过调控细胞凋亡、氧化应激、脂质代谢等不同的病理生理过程参与T2DM肾脏损害的发生发展。GSPB2可能通过调控这些差异表达的蛋白质来发挥对糖尿病肾病的保护作用。3. MFG-E8可能通过调控ERK1/2、Akt. GSK-3β的信号通路参与糖尿病肾病的发生发展。GSPB2对db/db小鼠肾脏具有明确的保护作用,其机制可能与抑制肾脏MFG-E8蛋白的表达,抑制肾脏ERK1/2. Akt、GSK-3β的磷酸化水平有关。