多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）是造成牛出血性败血病，羊败血病或肺炎，鸟类禽霍乱，猪萎缩性鼻炎，兔脓血症等多种动物疾病的原因，给世界各地的畜牧业造成巨大的经济损失。目前，预防和控制巴氏杆菌病的疫苗有弱毒苗和灭活苗，但由于巴氏杆菌血清型较多，不同菌株间缺乏相应的交叉保护，且疫苗保护期较短等原因，该病仍未得到有效的控制。2008年以来，我国一些省份相继检测出牛源A型多杀性巴氏杆菌，它主要引起牛肺炎。由于现有疫苗株均为B型巴氏杆菌，还没有针对A型多杀性巴氏杆菌的疫苗，因此，人们希望研究出一种能对多种巴氏杆菌血清型菌株提供交叉保护且有安全保证的新型疫苗。　　伴随着基因组学和蛋白质组学技术的发展和应用，人们对疫苗的研究进入了一个新的时期。现在，已经越来越多的病原微生物完成了全基因组序列的测序，这就为利用反向疫苗学研发各种新型疫苗提供了数据平台。以研究基因组序列为基础的“反向疫苗学”已经越来越多地应用到新型疫苗的研发中，逐渐成为一条新的疫苗研制途径。反向疫苗学通过对病原生物的基因组序列分析，预测出潜在的具有免疫原性的候选抗原，不必进行大量病原微生物培养，即可通过高通量表达，利用蛋白免疫印迹或间接ELISA等免疫学方法分析、筛选和鉴定出特异性抗原，并在小鼠模型中检测候选抗原的免疫保护性，从而筛选出具有保护性的抗原，作为疫苗的免疫抗原，为研制有效的疫苗提供理论依据。这不仅提高了候选疫苗的筛选成功率，同时还有助于预测和发现以往所不知的各种免疫原，具有十分重要和深远的意义。　　按照反向疫苗学的思路，本研究所做的具体研究内容及结果如下:　　1、牛源A型多杀性巴氏杆菌保护性抗原的初步筛选及克隆表达　　本实验室前期已经完成对牛源A型多杀性巴氏杆菌CQ2株的全基因组测序和分析，预测其编码的基因并注释编码的功能蛋白，构建了PmCQ2株全基因组序列本地数据库。本研究就是利用反向疫苗学的思想，应用生物信息学方法，如在线分析工具SignalR-3.0 server、SMART、TMHMM Server v.2.0对PmCQ2的部分蛋白进行分析，筛选出具有信号肽或跨膜结构域的蛋白作为保护性抗原候选分子，最终筛选出56个保护性抗原候选基因。将抗原候选基因分别设计特异性引物，经PCR克隆，进行双酶切反应后，与同样进行双酶切反应的原核表达载体pET-32a(+)连接构建重组载体，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导和SDS-PAGE分析，56个重组目标蛋白均成功在大肠杆菌中实现表达。　　2、牛源巴氏杆菌保护性抗原候选分子的间接ELISA方法筛选　　将56个重组蛋白大量诱导表达后，收集菌体，用Ni柱对融合蛋白进行纯化。本实验室前期工作已经完成了对牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2株的36个推定蛋白克隆表达和纯化，将这92个纯化后蛋白经透析复性后包被酶联板，利用4种牛血清:A型人工感染血清、A型灭活苗免疫血清、B型人工感染血清和F型人工感染血清，按照间接ELISA方法来筛选具有良好反应原性的蛋白。最终筛选出只能与A型血清反应而不与B、F型血清反应的PmA型特异蛋白2个;只与A型人工感染血清反应，不与A型灭活苗血清反应的PmA型差异蛋白13个;均能与A型、B型和F型反应的共有蛋白20个。　　3、部分保护性抗原候选分子对小鼠的免疫保护性研究　　为了验证所筛选部分蛋白对免疫动物的保护力，本研究以小鼠为模型，将PmA型、PmB型和PmF型共有蛋白2个(1，L17)和PmA型差异蛋白2个(11，L16)用弗氏佐剂乳化后，分别皮下免疫小鼠。检验四种蛋白对A型巴氏杆菌的保护力时，免疫剂量设置两个梯度，实验组1每只小鼠免疫50μg，实验组2每只小鼠免疫75μg，三免后第10天以3LD50剂量攻毒牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2株，结果发现四种蛋白对PmCQ2株抵抗力都很高，可达50％以上;75μg高免疫剂量与50μg低免疫剂量相比，11号蛋白的免疫保护率明显提高，由原来的70％上升到90％。检验四种蛋白对B型和F型巴氏杆菌保护性时，每只小鼠免疫剂量均为75μg，三免后分别3LD50剂量攻毒B型和F型巴氏杆菌，结果发现，1号，11号，L17号蛋白对B型均有较高的保护性，但对F型巴氏杆菌保护性较低。而L16号蛋白对B型、F型的免疫保护性均较低，这个结果也与间接ELISA实验相吻合。　　综上所述，本研究利用反向疫苗学所筛选了92个保护性抗原候选分子，并经间接ELISA筛选后，在小鼠模型中验证其免疫保护力，结果证实，蛋白1号，11号，L17号三种蛋白在小鼠模型中，能够提供对A型、B型巴氏杆菌较高的交叉保护性，提示可以作为牛源多杀性巴氏杆菌有效的疫苗，为多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗提供靶标。