随着近年来常见水果品种的普及,人们越来越喜爱如桑葚、树莓、车厘子等第三代水果。由于三代水果口感好,营养丰盛,富含具备保健功能的营养因子,所以,无论鲜食还是用于食品或保健品的开发,价格都相当昂贵。因此,其产品常会出现以假乱真、以次充好的现象,如某些桑葚加工品中不含桑葚,用廉价水果加香精来达到以假乱真的效果,这不单单欺骗了消费者,也极大地扰乱了市场秩序。运用现代生物信息学的方法和数字PCR技术,可建立快速、准确的定性、定量检测方法,为保证食品质量和维护消费者利益提供监察技术手段。本试验通过运用生物信息学的方法,利用perl语言程序下载多种常见水果基因组,并通过BLAST序列比对筛选出桑葚的特异性基因,从筛选的29262条序列经分析筛选出目标序列进行引物设计,同时根据桑葚的这段序列设计出实时荧光PCR和数字PCR的引物、探针,通过对引物和探针的特异性、引物浓度和最适反应退火温度进行了筛选和优化,建立物种特异性定性、定量检测方法,并对方法的灵敏度、检出限和加工品的适用性进行测试。(1)桑葚物种特异性常规PCR鉴定方法的建立:通过对桑葚物种特异性验证,PCR反应体系和反应程序条件的优化,以及方法灵敏度的确定,试验结果表明,本研究建立的方法物种特异性好,最适宜的退火温度为56℃,引物浓度为0.6μmol/L,在优化后的扩增条件下能够检测出质量分数为0.05%的样品(DNA,25 ng/μL),且重复性高。本方法对桑葚纯果汁、桑葚掺橙汁混合果汁、桑葚掺桃汁和苹果汁混合果汁、桑葚掺桃汁以及梨汁混合果汁样品分别进行了检测,样品中的桑葚成分均能检出。(2)桑葚物种特异性实时荧光定量PCR鉴定方法的建立:通过桑葚物种qPCR反应体系的优化,特异性和灵敏度检测,依据标准DNA溶液扩增曲线绘制了桑葚物种特异性基因的标准曲线,完成了对桑葚原性成分定量的检测。结果显示,本法具有特异性强、灵敏度高的特点,定量检出限0.006 ng/μL的桑葚基因组DNA,桑葚DNA扩增的标准曲线的方程为:y=3.529x+127.18,R2=0.995,扩增效率E%为92.032%,可以用于定量检测桑葚加工品。本方法可检测桑葚成分含0.01%的桑葚纯果汁以及可鉴定含有桑葚的混合果汁。(3)桑葚物种特异性数字PCR鉴定方法的建立:在实时荧光PCR试验筛选的引物和探针基础上,通过特异性试验、引物和探针浓度的优化、退火温度的优化以及定量线性范围和LOQ验证,确定了最佳引物和探针浓度均别为0.4μmol/L,最适宜的退火温度是57.9℃,定量检出限可达到0.006 ng/μL的桑葚基因组DNA,根据数字PCR曲线方程可计算出样品浓度,用于桑葚加工品的定量检测。综上所述,本研究基于生物信息学方法,结合定性PCR、实时荧光PCR、数字PCR技术建立了桑葚物种特异性分子生物学鉴定方法。该方法适用于各种桑葚果汁及加工品的掺伪鉴定,可为食品中桑葚源性成分定性、定量检测提供了技术支撑。