核桃miR164及其靶NAC家族基因鉴定与相关基因在成花过程中的表达分析

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目的:核桃是新疆地区的主要园艺产业之一,主要以干果来实现其经济价值。因此,核桃正常的开花结果就显得尤为重要。研究核桃成花,对其品种改良及稳产增效具有重要意义。前人研究表明,miR164通过介导NAC基因对花器官原基和分生组织的形成发育发挥调控作用,同时,NAC转录因子在影响雄蕊数量及花器官发育过程中发挥调控作用。为更清晰的了解核桃成花过程的分子机理,探究miR164与NAC家族对核桃成花过程的调控方式,有必要对核桃中的miR164和NAC家族进行鉴定和研究。方法:以雌花芽形态未分化期、形态分化始期和雌花原基分化期为采样时间点,结合徒手切片观察,分别于6月2号、6月6号和6月10号采集核桃‘温185’的雌花芽、雄花芽和叶芽。利用小RNA测序鉴定核桃中的miR164家族,并利用序列比对、进化分析、靶基因预测、实时荧光定量PCR检测等方法,对核桃miR164进行分析。同时,利用生物信息学的方法,通过序列比对、进化分析、共线性分析、蛋白互作及实时荧光定量PCR分析等方法,对核桃NAC转录因子家族进行了鉴定和分析,此外,探讨了核桃中miR164对靶NAC基因的调控方式,并进行了核桃中基于jre-miR164/NAC调控模式下的网络调控预测。最后,克隆并分析了JrNAC38基因并利用RT-q PCR实验分析了其对花芽和叶芽发育可能存在的影响。结果:(1)利用小RNA测序,获得了核桃中的两个miR164成员,序列比对发现,miR164成熟体序列高度保守,长度均为21nt,各序列间仅存在3`端个别碱基的差异,主要以第21位碱基处差异最大。但miR164前体序列差异较大,进化分析发现,jre-miR164与胡桃科物种间的亲缘关系最近。对jre-miR164的基因表达分析表明,其可能通过调控靶NAC基因从而影响花芽和叶芽中幼生器官的形成与发育;(2)通过在线网站ps RNATarget预测到jre-miR164的八个靶基因,其中六个为NAC家族成员,它们分别属于核桃NAC1亚族和NAM亚族中的NAC1、CUC1和CUC2基因,且它们与拟南芥的NAC1、CUC1和CUC2基因在进化上高度一致。通过RT-q PCR分析发现,核桃中jre-miR164对JrNAC1、Jr CUC1和Jr CUC2基因的调控方式为抑制;(3)在核桃全基因组范围内共鉴定到121个NAC家族成员,共分为15个亚族。序列分析显示,各亚族成员间序列存在差异。共线性分析显示,JrNAC基因在拟南芥、葡萄和杨树中存在多个同源基因,26个JrNAC基因在核桃基因组内发生了的基因复制。表达分析显示,JrNAC115和JrNAC8两个基因在雌花芽、雄花芽和叶芽中显著表达,同时,其他基因也存在不同时期不同程度的上调表达,推测这些JrNAC基因在可能在花芽和叶芽发育中发挥关键作用。此外,探讨了参与miR164/NAC调控模式下其他基因对该调控模式可能存在的影响,并据此对核桃中参与jre-miR164/JrNAC调控过程的基因间可能构成的网络调控模式进行了预测;(4)对在花芽中高表达的JrNAC基因进行了克隆,成功获得了一条全长805bp的JrNAC38基因,分析发现其为非跨膜蛋白,且不存在信号肽,其高级结构预测主要由α螺旋、延伸链、转角和无规则卷曲四种结构组成。RT-q PCR分析发现JrNAC38基因在核桃花芽和叶芽的发育过程中可能发挥了调控作用。结论:核桃miR164家族成员序列保守性很高,而NAC家族各亚族内成员序列保守性较高,但仍具有多样性,前者与胡桃科植物间的进化关系最近。相比于其他植物,二者均与木本植物间的进化关系更近。核桃中jre-miR164通过调控NAC1、CUC1和CUC2可能影响核桃雌蕊原基、雄蕊及叶芽原基的形成与发育,同时,可能对幼生器官边界的建立产生影响。此外,NAC其余亚族成员可能同样参与了花芽和叶芽的发育,且可能存在其他基因对jre-miR164/JrNAC的调控作用。
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