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【背景】近年来随着人类生活水平和饮食习惯的改变,胃恶性肿瘤的发病率逐年降低,但是胃癌（GC）仍然是全球第五大常见癌症,也是全球第四大癌症死亡原因。2018年,胃癌死亡率占全球癌症死亡人数的8%以上,目前胃癌5年总体生存率仅仅只有20-30%。在中国,由于我们持续加强对胃癌发生相关危险因素的控制和持续不断的对胃癌筛查工作的开展,胃癌患者的整体发病率和死亡率呈现下降趋势,但是胃癌仍然是消化系统的高度恶性肿瘤,早期胃癌无特异性症状,常发现远处器官转移,如肝、淋巴结转移、腹膜和肺等器官的转移,所以寻找胃癌早期特异性诊断标记物和探索胃癌发生分子机制仍然是胃癌研究的热点。目前内镜检查加活组织病理诊断仍然是诊断胃癌的金标准,但是这是一种侵入性操作,所以研究者致力于发现新的早期诊断方法,最近研究发现提高恶性肿瘤的早期诊断水平方法有血液检查、基因检测以及肿瘤标记物检测等等,目前已经鉴定出多种生物标志物,如细胞外囊泡和颗粒、尿DNA甲基化测定、血浆hsacirc0000745水平和CEA的组合。其中Circ RNAs已成为研究热点,Circ RNAs是一种非编码RNA,可以作为竞争性内源RNA（ce RNA）并在转录过程中发挥重要作用,已成为肿瘤细胞增殖、分化、凋亡和侵袭以及癌症诊断、存活和转移的关键基因。但目前关于Circ RNAs在胃恶性肿瘤中作用和机制尚未完全阐明。鉴于以上研究背景,我们通过在胃癌组织和癌旁正常胃组织转录组测序发现Circ TMC5在胃癌组织中高表达,本课题拟探讨Circ TMC5在胃癌中的生物学作用及可能机制。【目的】1.探索Circ TMC5在胃癌组织和胃癌细胞株表达情况,分析Circ TMC5表达在胃癌患者中的临床意义、诊断和预后的价值。2.探索Circ TMC5对胃癌细胞株的生物学作用。3.探讨Circ TMC5/mi R-365-3p/RABL6调控轴相互关系,以及对胃癌生物学作用。4.探讨RABL6在胃癌免疫调控中的生物学作用。【方法】1.通过胃癌组织和癌旁正常胃组织转录水平测序寻找到差异表达Circ RNAs谱,发现Circ TMC5并鉴定。2.q RT-PCR检测胃癌组织和癌旁正常胃组织中Circ TMC5表达水平,根据Circ TMC5中位表达水平,分为高表达组和低表达组;分析Circ TMC5表达与胃癌患者临床意义、预后的关系,进一步通过单因素和多因素Cox回归分析构建预后风险比例模型,对胃癌患者预后因素进行分析。3.通过q RT-PCR检测Circ TMC5在胃癌患者和正常健康志愿者血液表达情况,通过ROC曲线分析Circ TMC5在胃癌患者的诊断价值。4.构建Circ TMC5低表达稳定转染胃癌细胞株,通过CCK-8、EDU细胞增殖实验、流式细胞仪、Transwell实验检测低表达Circ TMC5对胃癌细胞株增殖、凋亡、侵袭和转移的生物学作用。5.通过Western Blotting检测低表达Circ TMC5对胃癌细胞凋亡、转移、上皮间质转化（EMT）等相关蛋白表达的生物学作用。6.通过RNAhybrid 2.2软件预测Circ TMC5与mi R-361-3p的靶向结合位点,通过DIANA-Tar Base v8数据库预测mi R-361-3p与RABL6靶向结合位点;进一步通过荧光原位杂交技术（FISH）实验证明Circ TMC5和mi R-361-3p在胃癌细胞表达位置,双荧光素酶报告实验验证了Circ TMC5与mi R-361-3p以及mi R-361-3p与RABL6的靶向结合关系;q RT-PCR验证Circ TMC5、mi R-365-3p、RABL6在胃癌组织和胃癌细胞株中表达情况。7.将过表达Circ TMC5、mi R-361-3p mimic、过表达RABL6载体在胃癌细胞株中共转染,通过CCK-8、EDU细胞增殖实验、流式细胞仪、Transwell实验检测Circ TMC5/mi R-365-3p/RABL6调控轴对胃癌细胞株增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学作用影响;通过q RT-PCR在胃癌组织中检测Circ TMC5、mi R-365-3p、RABL6 m RNA表达以及分析相互之间的关系;通过q RT-PCR和Western blotting在胃癌细胞株中检测Circ TMC5/mi R-365-3p/RABL6调控轴表达及相互关系。8.基于Oncomine和UALCAN生物信息数据库分析RABL6在胃癌组织和正常胃组织表达情况,进一步通过免疫组化方法验证在胃癌组织中RABL6蛋白表达情况,并基于Linked Omics生物信息数据库分析RABL6可能的生物学功能。9.基于Linked Omics生物信息数据库分析RABL6可能参与胃癌免疫调控,通过TISIDB和TIMER生物信息数据库分析RABL6与胃癌免疫微环境中趋化因子和免疫细胞的关系;通过免疫组化验证在胃癌组织中RABL6表达与胃癌免疫微环境中趋化因子和免疫细胞的关系。【结果】1.Circ TMC5在胃癌组织、胃癌患者血浆和胃癌细胞株中高表达,Circ TMC5表达与胃癌组织分化程度、病理分期、T分级有关（P＜0.05）,但与胃癌患者性别、年龄、饮酒、吸烟、CEA表达水平、淋巴结转移、幽门螺杆菌感染和肿瘤大小无关（P＞0.05）。2.Circ TMC5在胃癌组织中具有诊断作用,ROC曲线分析表明:CEA作为诊断标志物的AUC为0.910（敏感性:0.863;特异性:0.793;P＜0.001）,而Circ TMC5的AUC为0.821（灵敏度:0.619;特异性:0.922;P＜0.001）,然而,当CEA和Circ TMC5组合,AUC为0.941（灵敏度:0.791;特异性:0.948;P＜0.001）,CEA和Circ TMC5可以作为联合诊断胃癌的诊断标志物。3.Kaplan-Meier生存分析发现高表达Circ TMC5胃癌患者总体生存率较低（P=0.002）,而单变量或多变量Cox回归分析证实Circ TMC5表达、胃癌组织分化程度和病理分期是胃癌患者的独立预后因素（P＜0.05）。4.低表达Circ TMC5促进胃癌细胞凋亡,抑制胃癌细胞增殖、侵袭和转移。5.基于生物信息预测软件、FISH实验、双荧光素酶报告实验证明Circ TMC5与mi R-361-3p、mi R-361-3p与RABL6 m RNA存在靶向结合关系;在胃癌组织中发现Circ TMC5与mi R-361-3p表达存在负相关（r=-0.4158,P＜0.0001）,mi R-361-3p与RABL6 m RNA表达存在负相关（r=-0.3356,P=0.0004）,Circ TMC5与RABL6m RNA表达存在正相关（r=0.247,P=0.015）;与胃粘膜正常上皮细胞株比较,胃癌细胞株中Circ TMC5高表达,mi R-361-3低表达以及RABL6 m RNA高表达。6.体外研究表明过表达Circ TMC5通过海绵样吸附抑制mi R-361-3p表达,从而上调RABL6表达以抑制胃癌细胞凋亡,促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭;而mi R-361-3p上调具有相反的作用;体内实验验证Circ TMC5/mi R-365-3p/RABL6调控轴相互关系。7.RABL6在胃癌组织中高表达,基于生物信息数据库分析和免疫组化表明RABL6参与胃癌免疫微环境浸润中的趋化因子和免疫细胞的调节。【结论】Circ TMC5在胃癌组织中高表达,具有促进胃癌恶性程度的作用,Circ TMC5和CEA联合检测可以作为诊断胃癌分子标记物,Circ TMC5是胃癌患者预后的独立危险因素;低表达Circ TMC5可促进胃癌细胞凋亡,抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT改变;Circ TMC5促进胃癌恶性程度机制可能是通过海绵样吸附作用抑制mi R-361-3p表达,从而上调RABL6表达,以影响胃癌生物学行为;RABL6对胃癌免疫微环境中趋化因子和免疫细胞存在调节作用,RABL6也显示出胃癌靶向治疗前景,这些研究结果对胃癌发生机制提供新的研究方向。