人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)是高度变异的人类病原体,在抗逆转录病毒药物压力下,快速突变产生耐药性,导致抗逆转录病毒治疗(antiretroviral therapy,ART)的失败。耐药HIV毒株还可以传播,使得从未接受过抗病毒治疗的艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS,获得性免疫缺陷综合征)病人具有对药物的耐受性。HIV的耐药性已成为严重的公共卫生问题,是艾滋病防治的主要障碍。了解HIV耐药的分子进化规律并理解新耐药突变的作用,是全面认识HIV耐药分子机制的基础,将为有效遏制耐药毒株、做好针对耐药毒株的艾滋病防治提供科学依据。为了揭示血浆和外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中HIV耐药的分子进化规律、阐明新型耐药突变对耐药的贡献,本研究以河南某乡接受抗病毒治疗艾滋病患者队列为基础,开展了系列研究。首先对河南某乡接受抗病毒治疗的艾滋病患者更换二线药物前后的病毒耐药发生和演变情况进行了调查,对部分患者进行了病毒分离培养和基因型耐药鉴定;然后,基于长期随访获得的部分患者系列血浆和PBMCs标本,采用大量克隆测序及基因型耐药分析的方法,揭示血浆和PBMCs中耐药准种进化的规律;针对患者中大量出现的尚未有明确表型解释的H221Y突变,通过构建系列突变病毒并进行表型耐药测定的方式,阐明H221Y及其它突变联合对耐药的作用。第一部分河南某乡接受抗病毒治疗的艾滋病患者更换二线治疗方案前后的耐药性研究河南某乡是我国最早开展艾滋病免费抗病毒治疗的地区之一,采用的是使用统一的治疗方案、同时开始治疗,由村医管理患者并监督服药的治疗模式。自初始治疗(2003年9月)起,我们实验室对这个地区艾滋病患者的HIV耐药情况进行了连续7年的监测。根据患者的临床表现、病毒载量、CD4+T淋巴细胞计数检测的结果及病毒耐药监测的结果,2010年2月起,部分患者由一线治疗方案更换为二线治疗方案。本部分研究的目的是了解更换二线治疗方案后的HIV耐药发生发展的特点和规律,同时,观察更换二线治疗方案后的病毒学和免疫学应答,从而为抗病毒治疗方案的改进提供依据。对抗病毒治疗患者队列中的77名患者进行了两次随访,时间为2009年10月和2010年6月,共调查和采血154人次。其中43例患者在首次随访时(2010年2～3月)更换了二线治疗方案,34例患者仍然使用一线治疗方案。对所有患者使用统一的调查表进行流行病学调查,了解服药依从性、临床表现等信息,采集血液标本进行病毒载量和CD4+T淋巴细胞计数检测,采用耐药基因型方法进行耐药性检测和分析。主要结果和结论有:1.换药组患者在换药3个月后病毒载量显著下降(P值=0.005)。病毒抑制率由治疗前的46.34%(19/41)上升至换药后的65.80%(27/41);未换药组患者的病毒载量也显著下降(P值<0.05),病毒抑制率由首次随访的21.86%(7/32)上升至第二次随访的40.63%(13/32)。2.换药组患者在换药前后CD4+T淋巴细胞计数没有显著变化(P=0.279),换药前CD4+T淋巴细胞计数>350cells/μl的患者有39.53%(17/43),换药后有44.19%(19/43),比换药前略有增加;未换药组在两次随访中CD4+T淋巴细胞计数也无显著变化(P值=0.608),首次随访时CD4+T淋巴细胞计数>350cells/μl的患者有82.35%(28/34),第二次随访时CD4+T淋巴细胞计数>350cells/μl的患者的比例是70.59%(24/34)。3.换药组和未换药组患者在第二次随访中耐药的比例均有所下降:换药患者的耐药率由换药前的7/9降至换药后的6/11;未换药患者的耐药率人群由首次随访的12/20降至第二次随访的7/14。换药的患者在换药前后耐药毒株的演变情况较未换药患者更为复杂。总体来看,换药显著提高了患者的病毒抑制率,长久也将观察到免疫功能的改善,对耐药的影响还需要进一步观察。第二部分血浆RNA和PBMCs DNA HIV-1耐药准种多态性和分子进化HIV在体内以复杂的准种形式存在,在不同种类和强度的药物选择压力下,HIV-1的耐药性随时间序贯发展、逐渐增强,病毒准种的组成和分布始终处于动态变化的过程中。耐药不是全或无的现象,优势与劣势耐药准种共存,某些劣势种群可以持续进化,最终发展成为优势种群。在HIV感染发展的过程中,病毒基因组的各种变化被持续地记录在潜伏整合的前病毒中,耐药突变持续不断地进入潜伏的病毒库。耐药毒株的进化在不同组织是独立的,有研究报道血浆与外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)、淋巴及神经组织中耐药准种的分布显著不同,通常认为血浆可即时反应体内病毒的耐药进化,是世界卫生组织(World Health Organization,WHO)指定的HIV-1耐药检测和监测常规使用的样本。尽管目前对血浆中耐药毒株的分子进化已经有了比较深入的认识,但对长期治疗患者血浆中耐药病毒准种的进化特征、PBMCs中耐药病毒准种的进化特点、血浆与PBMCs中耐药病毒准种的动态进化关系还没有系统的研究。本研究的目的是,通过对河南省某农村长期接受抗病毒治疗艾滋病患者的系列血浆和PBMCs标本的大量克隆测序、基因型耐药和分子进化分析,阐明我国农村特殊抗病毒治疗模式下血浆和PBMCs中病毒耐药准种的分子进化规律,揭示血浆和PBMCs中病毒耐药准种的进化关系。从河南省某乡HIV耐药监测队列中选出6名长期接受抗病毒治疗的艾滋病患者,这些患者最少的随访8次、最多的随访10次,累计随访54人次、时间跨度5年。每次随访均对研究对象进行访谈,了解临床表现、抗病毒治疗方案、服药依从性及其他社会人口学特征。对血浆和PBMCs分别采用RT-PCR和直接巢式PCR方法扩增HIV-1蛋白酶和逆转录酶区2162bp基因片段,然后克隆测序。每份样品对20～30个克隆测序,共获得序列1588条,其中来自血浆样本的序列967条,来自PBMCs前病毒的序列621条,对序列进行耐药突变和进化分析,主要结果和结论如下:1.血浆与PBMCs中耐药准种的分布:血浆中蛋白酶抑制剂(protease Inhibitors,PIs)耐药突变、核苷类逆转录酶抑制剂(nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NRTIs)、非核苷类逆转录酶抑制剂(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NNRTIs)的耐药突变种类比PBMCs中的突变种类多。多数患者血浆和PBMCs样本中共同出现的耐药突变也是两种样本中发生频率较高的突变,即血浆和PBMCs两种组织中占优势地位的耐药准种形式差别不大;2.血浆与PBMCs中耐药准种的进化:多数患者PBMCs中PIs耐药突变、NRTIs、NNRTIs耐药突变的发生晚于血浆。少数患者血浆和PBMCs两种组织呈现完全不同的耐药进化路径。6例患者血浆和(或)PBMCs中NRTIs耐药谱和NNRTIs耐药谱的进化路径均不同程度地显示出,随着接受治疗时间的延长,主要突变谱携带的突变种类增加,即突变谱的进化都有突变位点累积的趋势,并且随之产生的耐药程度也逐渐增加;3.血浆与PBMCs中NRTIs耐药谱的特点:6例患者几乎所有血浆和(或)PBMCs NRTIs耐药谱中都有T215Y,而且该突变在随访早期即单独或同其它突变一起出现,早期联合出现的以M41L居多,这两种突变通常稳定存在于随访的整个过程, L210W常在随访中晚期累加进NRTI突变谱,累加的其它突变还有D67N、K70R、E44D(A)等,个别患者T215Y突变模式到晚期有被T215F取代的趋势。NRTIs耐药谱的耐药程度常与其携带的突变种类有关,往往携带的突变种类越多,耐药程度也越高;4.血浆与PBMCs中NNRTIs耐药谱的特点:总的来讲,NNRTIs耐药谱不如NRTIs耐药谱复杂,携带的突变种类不如NRTIs耐药谱多。6例患者中,除2例患者的血浆样本之外,其他患者的样本都出现了Y181C,该位点一旦出现,就会稳定存在至随访末期;K103N是另外一个重要的NNRTIs突变,在4例患者中都有出现,值得注意的是,该位点在1例患者的血浆样本和1例患者的PBMCs样本中只是在随访早期一过性出现,在其他样本中早期出现后可持续存在至随访末期;除1例患者的血浆和PBMCs样本以及1例患者的PBMCs样本之外,其它样本中都出现了H221Y突变,不同样本中该突变出现的时间不同,有的在随访早期或中期出现,有的在随访晚期才累加入NNRTIs耐药谱,该位点也是一旦出现,就会持续存在于突变谱中。NNRTIs耐药出现得较早,耐药程度往往很高,单位点突变也可导致对NVP的高度耐药;5.血浆与PBMCs中多重耐药谱的特点:血浆样本中的多重耐药(multidrug resistance,MDR)谱的构成形式比PBMCs中的复杂,多重耐药谱的种类也比PBMCs样本多;NRTI+NNRTI双重耐药谱是MDR的主要构成形式,在所有样本中都有出现;其次是PI+NRTI+NNRTI三重耐药谱,6例患者的血浆样本中都有出现;MDR的耐药程度往往比较高;6.血浆与PBMCs中准种序列的离散率:2例患者血浆准种的离散率大于PBMCs样本中的离散率,1例患者血浆准种的离散率小于PBMCs样本中的离散率,1例患者历次血浆和PBMCs的平均离散率没有有统计学意义差异,但是这些患者血浆中耐药谱的复杂程度都高于PBMCs样本,提示基因离散率不能代表样本中耐药准种的复杂程度。第三部分体外无药物选择压力条件下HIV-1耐药突变的演变HIV-1耐药准种在体内药物选择压力下呈现复杂的动态变化和进化,在体外感染细胞的过程中,携带各种耐药突变的病毒准种在靶细胞中生长,在没有药物压力的情况下,病毒产生复杂的变化,有可能发生回复突变,也可能发生各种准种的竞争性生长,最终具有最佳复制能力和复制适应性的病毒能够有效生长,成为在体外稳定传代生长的病毒,这种变化在一定程度上反映了各种突变对病毒造成的复制适应性损失的程度。本部分研究通过对接受抗病毒治疗的艾滋病患者HIV-1毒株的体外传代培养,观察体外无药物压力条件下HIV-1耐药毒株的体外生长以及主要耐药突变的演化趋势,从而揭示各种耐药性基因突变对病毒复制能力和复制适应性的影响。我们采集了15例服用拉米夫定+司他夫定+萘韦拉平(3TC+D4T+NVP)的艾滋病患者的外周血单核细胞,用体外共培养的方法分离HIV-1毒株,观察这些毒株在体外无药物压力下的生长情况及耐药基因突变的演变。主要结果如下:1.15例患者中病毒载量>1000拷贝/毫升的有8例,均成功分离出稳定传代的原代毒株,对这些毒株的体外复制动力学进行分析,有3株病毒呈快/高型生长方式,有5株呈慢/高型生长方式。2.8株病毒中有2株为耐药毒株,所携带的主要耐药突变分别是K103N/K238T和M184V/K103N/Y181C/H221Y,分别对NVP和3TC/NVP高度耐药。无药物压力情况下,携带K103N突变的毒株具有较好的复制适应性,可稳定存在;携带M184V和K103N/Y181C/H221Y的毒株也能够稳定复制;K238T耐药突变稳定性差,易发生回复突变。第四部分H221Y突变及与其它突变联合对NVP耐药作用的研究H221Y突变是近年来发现的与NVP治疗相关的的NNRTI类耐药相关突变,在我国接受抗病毒治疗的艾滋病患者中广泛流行。本论文第二部分研究中6例患者均出现了该突变,并且该突变在准种中出现的频率多大于30%,到随访后期(初始治疗31个月后)出现频率多大于90%。值得注意的是,该部分研究中H221Y突变常伴随Y181C突变一起出现。此外,本论文第三部分分离出的原代耐药毒株HNNY15携带的NNRTI耐药突变组合为K103N/Y181C/H221Y,并且该突变组合在体外无药物压力下可稳定传代。目前,H221Y突变对耐药作用尚没有确定,对H221Y突变与其它突变的相互作用研究的也很少。本部分研究的目的是阐明H221Y突变单独及在各种NNRTI耐药突变组合中对耐药的作用。将来自患者的携带耐药突变的pol区646bp的基因片段连接至pNL4-3骨架质粒,在此基础上进行H221Y和(/或)Y181C的定点回复诱变,包装出携带各种NNRIs耐药突变组合的毒株,在TZM-bl细胞上进行NVP表型耐药检测和分析,结果和结论如下:1.构建和包装出20株携带不同突变组合的HIV毒株,分别是:以K101Q为基础的4株病毒,携带的突变分别是K101Q/Y181C/H221Y(1-1)、K101Q/Y181C(1-2)、K101Q/H221Y(1-3)、K101Q(1-4);以K101E为基础的4株病毒,携带的突变分别是K101E/Y181C/H221Y(2-1)、K101E/Y181C(2-2)、K101E/H221Y(2-3)、K101E(2-4);以V179E为基础的4株病毒,携带的突变分别是V179E/Y181C/H221Y(3-1)、V179E/Y181C(3-2)、V179E/H221Y(3-3)、V179E(3-4);以V179D为基础的4株病毒,携带的突变分别是V179D/Y181C/H221Y(4-1)、V179D/Y181C(4-2)、V179D/H221Y(4-3)、V179D(4-4);以K103N为基础的4株病毒,携带的突变分别是K103N/Y181C/H221Y(5-1)、K103N/Y181C(5-2)、K103N /H221Y(5-3)、K103N(5-4)。2.测定了12株病毒的TCID50和对NVP的IC50。毒株1-1、1-2、1-3、1-4、4-1、4-2、4-3、4-4、5-1、5-2、5-3、5-4对NVP的IC50分别是108.150±1.909μM、47.807±18.131μM、0.141±0.052μM、0.037±0.010μM、162.633±47.497μM、44.980±12.763μM、0.415±0.014μM、0.142±0.022μM、191.100±91.358μM、89.180±22.656μM、4.408±0.915μM、2.013±0.360μM、0.031±0.005μM。3.Y181C突变可大幅度提高毒株对NVP耐药的程度,在6种突变或突变组合(K101Q/H221Y、K101Q、V179D/H221Y、V179D、K103N/H221Y、K103N)的基础上,Y181C可使毒株对NVP的IC50分别提高759.144±41.903倍、1296.979±289.108倍、390.039±101.646倍、312.469±45.255倍、41.879±8.403倍和47.878±4.197倍。4.H221Y可在一定程度上增加各种NNRTIs耐药突变组合对NVP的耐药程度。在6种突变或突变组合(K101Q/Y181C、K101Q、V179D/Y181C、V179D、K103N/Y181C、K103N)的基础上,H221Y可使毒株对NVP的IC50分别提高2.237±0.910倍、3.238±0.317倍、3.644±0.469倍、2.969±0.435倍、2.080±0.496倍和2.183±0.091倍。5.Y181C/H221Y突变组合使携带K101Q、V179D和K103N突变毒株对NVP的IC50分别提高3444.646±834.542倍、1132.624±180.368倍和100.621±32.478倍。