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第一部分大鼠卵巢切除合并腰椎融合诱发邻近节段椎间盘退变模型的研究目的:本研究拟对卵巢切除（Ovariectomy,OVX）大鼠进行腰椎融合手术（Posterolateral lumbar fusion,PLF）,建立邻近椎间盘退变（Adjacent segmental intervertebral disc degeneration,ASDD）的动物模型。观察腰椎融合后相邻椎体和椎间盘的退变情况,进一步讨论腰椎融合术后ASDD病理情况以及去除卵巢引起雌激素减少对ASDD的影响。方法:将雌性3月龄Sprague-Dawley（SD）大鼠40只随机分为以下4组:Sham组（假手术组）、OVX组（双侧卵巢切除组）、PLF组（腰椎融合组）以及OVX+PLF组（卵巢切除合并腰椎融合组）。大鼠3月龄时进行OVX术,术后4周再行PLF术。PLF术是对L4-5节段双侧融合同时将自体髂骨研磨呈颗粒状进行自体骨移植并使用钢丝穿过棘突缠绕,使之得以固定。在PLF术4周后,对行PLF术的动物进行X-ray扫描检查,观察腰椎融合情况并进行影像学评分,随之安乐死动物并取材,保留L3-6节段及其椎间盘。采用手法评估去检测腰椎融合情况,对标本进行微计算机断层扫描技术（Micro-computed tomography,Micro-CT）检测,分离提取L5-6椎间盘及相邻椎体,进行脱钙、包埋、切片,并采用HE染色评估ASDD情况。结果:1融合评估1.1X线检测结果:与OVX+PLF组相比,PLF组L4-5节段新骨形成和影像学密度增加。同时影像学评分结果证实PLF组显著高于OVX+PLF组（P<0.05）。由于Sham与OVX组未行PLF术,故未参与融合评分。1.2手法检测结果:作为检测融合情况的金标准,对PLF和OVX+PLF组行手法检查,发现L4-5节段固定良好,并且缠绕棘突的钢丝完整,未检测到融合节段的活动情况。2 Micro-CT检测结果与Sham组相比,OVX组和OVX+PLF组合大鼠的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均显著降低（P<0.01）,而Tb.Sp显著增加（P<0.05,P<0.01）。然而Sham组与PLF组之间没有显著差异（P>0.05）。DHI评分在Sham组中显著高于OVX组,PLF组和OVX+PLF组（P<0.01）,OVX+PLF组的DHI评分显著低于OVX组和PLF组（P<0.05,P<0.01）,DHI评分在OVX组和PLF组之间未见显著差异（P>0.05）。3组织学检测及评分结果HE染色显示:与Sham组相比,OVX组、PLF组和OVX+PLF组髓核细胞减少且部分发生黏液样退变,纤维环排列紊乱,终板钙化增加,这种变化在OVX+PLF组中表现的尤为明显。组织学评分结果显示:与Sham组相比,OVX组、PLF组和OVX+PLF组评分显著增高（P<0.05）,与OVX组和PLF组相比,OVX+PLF组评分显著增高（P<0.05,P<0.05）,然而OVX组与OVX+PLF组之间无显著差异（P>0.05）。第二部分狄诺塞麦对卵巢切除大鼠合并腰椎融合诱发邻近节段椎间盘退变的作用目的:本研究拟对卵巢切除合并腰椎融合术诱导邻近节段椎间盘退变模型给予狄诺塞麦（Denosumab,Dmab）进行干预,从而观察Dmab对ASDD的作用。方法:将雌性3月龄Sprague-Dawley（SD）大鼠60只随机分为以下5组:Sham组、OVX组、PLF组以及OVX+PLF组和OVX+PLF+Dmab组,对大鼠分别行假手术（Sham组）,双侧卵巢切除（OVX组）,腰椎融合（PLF组）,卵巢切除合并腰椎融合（OVX+PLF组）和卵巢切除合并腰椎融合Dmab干预（OVX+PLF+Dmab组）。腰椎融合术72小时后,OVX+PLF+Dmab组大鼠经皮下注射给予Dmab治疗干预,剂量为0.25mg/kg/day,一周五天,其余各组大鼠经皮下注射给予等体积的生理盐水。在Dmab干预4周后对大鼠行安乐死并取材,保留L3-6节段及其椎间盘,同时采用手法评估去检测腰椎融合情况,随之行Micro-CT检测,提取L3-4椎间盘的m RNA行RT-PCR检测基质金属蛋白酶-13（Matrix metalloproteinase-3,MMP-13）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan,Agg）和血小板型金属蛋白酶4（A sidintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4,ADAMTS-4）m RNA的表达水平,将L5-6椎间盘及相邻椎体分离提取,并进行脱钙、包埋、切片。对L5-6椎间盘分别进行免疫组织化学染色检测MMP-13、Agg和ADAMTS-4的蛋白表达水平。结果:1手法检测:对PLF组、OVX+PLF组和OVX+PLF+Dmab组行手法检查,发现L4-5节段固定良好并且缠绕棘突的钢丝牢固完整,未检测到融合节段的活动情况。2 Micro-CT检测结果与Sham组相比,OVX组和OVX+PLF组合大鼠的BMD、BV/TV、和Tb.N均显著降低（P<0.01）,而Tb.Sp均显著增加（P<0.05,P<0.01）。与OVX+PLF组相比,OVX+PLF+Dmab组BMD、BV/TV和Tb.N均显著增加（P<0.01）,而Tb.Sp显著降低（P<0.01）。然而Sham组与PLF组之间没有显著差异（P>0.05）。3免疫组织化学染色与Sham组相比,OVX组、PLF组与OVX+PLF组中MMP-13（P<0.01）和ADAMTS-4（P<0.05,P<0.05,P<0.01）蛋白表达水平均增高而Agg（P<0.01）蛋白表达均降低。与OVX+PLF组相比,OVX+PLF+Dmab组中MMP-13（P<0.01）和ADAMTS-4（P<0.01）蛋白表达水平均显著降低而Agg（P<0.01）蛋白表达均显著增高。4 RT-PCR检测与Sham组相比,OVX组、PLF组与OVX+PLF组中MMP-13（P<0.01）和ADAMTS-4 m RNA（P<0.01）表达水平显著增高而Agg m RNA表达显著降低（P<0.01）。与OVX+PLF组相比,OVX+PLF+Dmab组中MMP-13（P<0.01）和ADAMTS-4 m RNA（P<0.01）表达水平显著降低而Agg（P<0.01）蛋白表达显著增高。第三部分狄诺塞麦对卵巢切除合并腰椎融合诱发相邻节段椎间盘退变作用机制的研究目的:本研究基于Dmab可以延缓卵巢切除大鼠合并腰椎融合后邻近节段椎间盘退变,然而其作用机制尚未研究,拟应用卵巢切除合并腰椎融合诱导邻近节段椎间盘退变模型,早期经皮下注射给予Dmab干预,进一步探讨Dmab对卵巢切除合并腰椎融合后大鼠邻近节段椎间盘退变的作用机制。方法:将雌性3月龄Sprague-Dawley（SD）大鼠60只随机分为以下5组:Sham组、OVX组、PLF组以及OVX+PLF组和OVX+PLF+Dmab组,对大鼠分别行假手术（Sham组）,双侧卵巢切除（OVX组）,腰椎融合（PLF组）,卵巢切除合并腰椎融合（OVX+PLF组）和卵巢切除合并腰椎融合Dmab干预（OVX+PLF+Dmab组）。腰椎融合术72小时后,OVX+PLF+Dmab组大鼠经皮下注射给予Dmab治疗干预,剂量为0.25mg/kg/day,一周五天,其余各组大鼠经皮下注射给予等体积的生理盐水。在Dmab干预4周后,安乐死动物并取材,保留L3-6节段及其椎间盘,Micro-CT分析L6椎体终板结构的变化,同时采用手法评估去检测腰椎融合情况。置于10%福尔马林溶液中固定保存,然后对标本进行脱钙、包埋、切片。对L5-6椎间盘进行免疫组织化学染色检测SOX-9（Sry related HMG box-9,SOX-9）和CD24（Cluster of differentiation 24,CD24）,番红O固绿染色染色评估ASDD情况。对L6椎体进行压缩试验检测椎体生物力学参数的变化。结果:1融合评估手法检测结果:对行腰椎融合的所有动物（PLF组、OVX+PLF组和OVX+PLF+Dmab组）进行手法检查,结果证实大鼠L4-5节段固定良好并且缠绕棘突的钢丝完整。均未检测到融合节段存在活动情况。2 L5-6终板检测在Sham组中可以观察到完整的终板结构,骨质结构相对紧密,在OVX组、PLF组和OVX+PLF组中发现终板存在不同程度骨质丢失的情况,同时发现终板上存不同程度的空隙,然而在OVX+PLF+Dmab中上述情况得以显著改善。分析结果证实,与Sham组相比,OVX组和OVX+PLF组中大鼠终板的Po.N均降低（P<0.05,P<0.01）,而Po（op）（P<0.05,P<0.01）和Po.V（tot）（P<0.01）显著增高。然而再给予Dmab治疗后,与OVX+PLF组相比,OVX+PLF+Dmab组中大鼠终板的Po.N均显著增高（P<0.01）,而Po（op）和Po.V（tot）均显著降低（P<0.01）。3组织学检测及评分结果番红O固绿染色显示,Sham组髓核内充大量的脊索细胞和细胞外基质,终板结构完整有大量的软骨细胞,纤维环排列整齐有序,然而与之相反,OVX组、PLF组和OVX+PLF组髓核内脊索细胞及围绕脊索细胞的细胞外基质显著减少并且部分发生黏液样退变,终板钙化严重伴有新骨形成,纤维环稀疏紊乱。上述退变情况在OVX+PLF组中表现的更加突出。然而,在给予Dmab干预后上述变化被显著抑制。组织学评分结果显示,与Sham组相比,OVX组、PLF组和OVX+PLF组评分显著增高（P<0.05）,与PLF组相比,OVX+PLF组评分显著增高（P<0.05）,然而OVX组与OVX+PLF组之间无显著差异（P>0.05）。与OVX+PLF组相比,OVX+PLF+Dmab组评分显著降低（P<0.05）。4生物力学检测椎体压缩实验证实,与Sham组相比,在OVX组、PLF组和OVX+PLF组椎体极限应力（Maximum stress）、弹性模量（Elastic modulus）、极限负荷（Maximum load）及屈服应力（Yield stress）均显著降低（P<0.01）。这些变化在OVX+PLF组中表现的更为明显,然而与OVX+PLF组相比,OVX+PLF+Dmab组极限应力、弹性模量、极限负荷及屈服应力均显著增加（P<0.01）。5免疫组织化学染色与Sham组相比,OVX组、PLF组与OVX+PLF组大鼠髓核中SOX-9的表达水平均显著增高（P<0.01）。与OVX组和PLF组相比,OVX+PLF组中SOX-9的表达水平均显著增高（P<0.01）。然而,与OVX+PLF组相比,OVX+PLF+Dmab组中SOX-9表达水平显著降低（P<0.01）。与Sham组相比,OVX组、PLF组与OVX+PLF组大鼠髓核中CD24的表达水平均显著降低（P<0.01）。与OVX组和PLF组相比,OVX+PLF组中CD24的表达水平均降低（P<0.05）。然而,与OVX+PLF组相比,OVX+PLF+Dmab组中CD24表达水平显著增高（P<0.01）。结论:1.切除卵巢大鼠行自体髂骨移植横突间合并棘突钢丝固定的腰椎融合术可以导致ASDD的发生。该模型对阐述ASDD病理改变以及后续治疗干预提供较好的动物模型基础。2.雌激素减少诱发的骨质疏松加重ASDD,提示在腰椎融合术后邻近节段椎间盘退变的病理进展中骨质疏松是一种重要的危险因素。在卵巢切除合并腰椎融合后相邻节段椎间盘退变动物模型中,早期给予Dmab药物干预可以改善椎体骨质疏松,延缓终板软骨的骨化,维持椎体骨密度和保持骨小梁结构的完整性,提示Dmab是防治ASDD的一种潜在性药物。3.Dmab不仅可以有效维持椎体的骨密度,还能通过促进成骨形成来改善椎体和终板骨小梁微结构维持椎体生物力学的性能,同时保护椎间盘结构功能的完整性,进而延缓ASDD的病理改变。