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近年来,糖尿病发病率明显增加。糖尿病可以造成骨吸收增加,骨形成减少,导致骨质疏松症。骨质疏松症是一种进展缓慢的骨代谢性疾病,在老年人中较常见,骨质丢失、骨微结构遭到破坏,骨脆性和骨折风险明显增加。胰高血糖素样肽-1受体激动剂（glucagon-like peptide-1 receptor agonists,GLP-1RA）为治疗2型糖尿病和肥胖症的新型降糖药物。近年体内外研究表明,GLP-1RA参与改善骨骼代谢。骨形成包括间充质前体细胞分化为成骨细胞前体、成骨细胞成熟与基质形成和矿化,研究表明,Wnt/β-catenin、Notch、骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins,BMP）、肿瘤生长因子（tumor growth factor,TGF）-β、PI3K/Akt/m TOR、促分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、Hedgehog（Hh）等多种信号通路参与成骨分化的多个阶段。本课题组前期研究发现长效GLP-1RA利拉鲁肽促进小鼠前成骨细MC3T3-E1细胞增殖分化和凋亡,本研究进一步探讨Notch,Wnt/β-catenin和Hh信号通路是否参与利拉鲁肽对MC3T3-E1细胞的调控作用。本研究分为四部分:第一部分利拉鲁肽通过Notch信号通路调控前成骨细胞MC3T3-E1增殖分化目的:探讨利拉鲁肽通过Notch通路调控前成骨细胞增殖分化机制。方法:1.为探究利拉鲁肽对MC3T3-E1细胞影响是否具有浓度和时间依赖性,参考课题组前期对利拉鲁肽的浓度梯度设置,将利拉鲁肽的浓度设置为0,10,100,500,1000nM,以不同浓度利拉鲁肽（0,10,100,500,1000nM）刺激体外培养的小鼠前成骨MC3T3-E1细胞,在细胞接种后第24、48和72h应用MTT法检测细胞存活和生长能力。2.用50mg/mL抗坏血酸和10mMβ-甘油磷酸钠诱导MC3T3-E1细胞成骨分化,分别加入0,10,100,500,1000nM利拉鲁肽,在培养第0、7、14天检测早期成骨分化指标碱性磷酸酶（ALP）活性,在第21天进行茜素红染色检测胞外基质矿化结节并计算其相对吸光度,在0、7、14、21、28天通过荧光定量PCR（qRT-PCR）检测成骨分化标志物COL1、OC、RUNX2和OPG mRNA表达水平,免疫印迹（WB）和qRT-PCR检测GLP-1R蛋白和mRNA表达水平。3.用100nM利拉鲁肽体外处理小鼠前成骨MC3T3-E1细胞,分别在0、20、40、60min用WB检测Notch信号通路分子（Notch1、JAG1和HES1）蛋白表达,检测胞内cAMP活性。4.参考Notch通路抑制剂DAPT使用说明,应用其推荐剂量50μM,用100nM利拉鲁肽和50μM Notch通路抑制剂DAPT处理MC3T3-E1细胞,48h后通过MTT检测细胞增殖情况和成骨分化标志物COL1、OC、RUNX2和OPGmRNA表达水平。5.用siRNA干扰GLP-1R表达,100nM利拉鲁肽处理MC3T3-E1细胞,48h后通过WB检测Notch信号通路分子（Notch1、JAG1和HES1）蛋白表达情况,检测胞内cAMP活性。结果:1.利拉鲁肽促进MC3T3-E1细胞增殖,其中100nM作用48小时增殖效果最明显。2.成骨分化因子Col-1、OC、RUNX2、OPG基因mRNA表达及ALP活性变化趋势表明利拉鲁肽诱导MC3T3-E1细胞分化为成熟的成骨细胞,利拉鲁肽处理上调成骨细胞标志物水平,增强其成骨分化,利拉鲁肽诱导后基质矿化面积明显增加,形成明显矿化结节。成骨分化过程中,GLP-1RmRNA和蛋白水平逐渐增加,利拉鲁肽处理增加第7天和14天时GLP-1RmRNA和蛋白水平。3.利拉鲁肽提高Notch相关分子Notch1、JAG1和HES1蛋白表达水平,处理后20分钟时达到峰值,然后逐渐降低,在60分钟时表达水平仍显著高于对照组;增加胞内cAMP活性,20分钟时达到峰值,60分钟时降至基础水平。4.利拉鲁肽提高MC3T3-E1细胞增殖活性和成骨分化因子Col-1、OC、RUNX2、OPG基因mRNA表达水平,应用DAPT同时处理显著降低MC3T3-E1细胞活性及Col-1、OC、RUNX2、OPG基因mRNA表达水平,减弱利拉鲁肽对MC3T3-E1细胞增殖作用和促成骨分化作用。5.利拉鲁肽显著上调Notch1,JAG1和HES1表达,干扰GLP-1R表达,降低Notch1,JAG1和HES1蛋白表达,降低利拉鲁肽对cAMP活性的增强作用。第二部分利拉鲁肽通过Notch信号通路与β-catenin交联调控MC3T3-E1细胞增殖分化目的:探讨Notch通路和β-catenin在利拉鲁肽对成骨细胞调节作用中的交互作用机制。方法:1.用100nM利拉鲁肽和50μM Notch通路抑制剂DAPT处理MC3T3-E1细胞,48h后通过qRT-PCR检测TCF7L2 mRNA水平,通过WB和免疫荧光检测β-catenin蛋白表达和胞内定位变化情况。2.用siRNA干扰β-catenin表达,100nM利拉鲁肽处理MC3T3-E1细胞,48h后通过qRT-PCR和WB检测Notch信号通路分子（Notch1、JAG1和HES1）mRNA和蛋白表达情况。结果:1.利拉鲁肽提高TCF7L2 mRNA水平,上调β-catenin表达并使其从细胞质转移定位到细胞核中,应用DAPT同时处理降低mRNA水平,降低β-catenin表达并使其仍然定位在细胞质中,抑制利拉鲁肽对β-catenin的激活作用。2.利拉鲁肽上调Notch1,JAG1和HES1表达,干扰β-catenin表达降低利拉鲁肽调控Notch1,JAG1和HES1蛋白表达。第三部分Notch信号通路和Hedgehog信号通路通过Gli1交联共同调控利拉鲁肽对MC3T3-E1细胞的增殖分化作用目的:探讨Hh信号通路调控利拉鲁肽对成骨细胞的调节,并且进一步探讨Hh信号和Notch信号的交互作用。方法:1.用100nM利拉鲁肽处理MC3T3-E1细胞,48h后通过qRT-PCR和WB检测Hh信号通路蛋白Hh和Gli1mRNA和蛋白表达水平。2.用siRNA干扰Gli1的表达,100nM利拉鲁肽处理MC3T3-E1细胞,48h后通过qRT-PCR检测成骨分化蛋白RUNX2和OCNmRNA表达水平。3.用100nM利拉鲁肽和10μM Hh通路抑制剂环粑明处理MC3T3-E1细胞,48h后通过qRT-PCR和WB检测Hh信号通路蛋白Hh和Gli1以及Notch通路分子Notch1,JAG1和HES1mRNA和蛋白表达水平。4.用100nM利拉鲁肽和50μM Notch通路抑制剂DAPT处理MC3T3-E1细胞,48h后通过qRT-PCR和WB检测Hh信号通路蛋白Hh和Gli1mRNA和蛋白表达水平。5.用siRNA干扰Gli1表达,100nM利拉鲁肽处理MC3T3-E1细胞,48h后通过qRT-PCR和WB检测Notch1,JAG1和HES1 mRNA水平和蛋白表达水平。结果:1.利拉鲁肽提高Hh信号通路蛋白Hh和Gli1mRNA和蛋白表达水平。2.干扰Gli1降低成骨分化蛋白RUNX2和OCNmRNA表达水平,抑制利拉鲁肽对成骨细胞分化的促进作用。3.利拉鲁肽激活Hh和Notch信号通路分子,应用环粑明同时处理降低Gli、Notch1、JAG1和HES1 mRNA水平和蛋白表达水平,抑制利拉鲁肽对Hh和Notch信号通路的激活作用。4.利拉鲁肽提高Hh和Gli1 mRNA和蛋白表达水平,激活Hh通路,应用DAPT同时处理可以显著降低Hh和Gli1 mRNA和蛋白表达水平,抑制利拉鲁肽对Hh的激活作用。5.干扰Gli1可以显著下调Notch1、JAG1和HES1 mRNA水平和蛋白表达水平,表明利拉鲁肽通过激活Hh通路调控Notch信号通路。第四部分Notch信号通路在利拉鲁肽调控前成骨细胞MC3T3-E1凋亡中的作用目的:探索Notch信号通路及交联分子GLP-1R、β-catenin和Gli1在利拉鲁肽调控MC3T3-E1细胞凋亡中的作用。方法:1.血清饥饿处理MC3T3-E1细胞24小时,然后用100nM利拉鲁肽和50μM Notch通路抑制剂DAPT处理MC3T3-E1细胞,48h后收集细胞通过流式细胞术检测细胞凋亡变化,通过WB检测Notch通路相关蛋白（Notch1,JAG1和HES1）和凋亡相关蛋白Bax,caspase-3和Bcl-2表达情况。2.分别干扰GLP-1R、β-catenin和Gli1,然后应用100nM利拉鲁肽处理细胞,48h后收集细胞通过流式细胞术检测细胞凋亡变化。结果:1.利拉鲁肽显著降低细胞凋亡发生,提高Bcl-2/Bax蛋白比例并降低caspase-3/pro-caspase-3比例,应用DAPT同时处理促进细胞凋亡,降低Bcl-2/Bax蛋白比例并提高caspase-3/pro-caspase-3比例,减弱利拉鲁肽对MC3T3-E1细胞凋亡的抑制作用。2.利拉鲁肽显著降低细胞凋亡,干扰GLP-1R、β-catenin或Gli1显著促进细胞凋亡。结论:1.利拉鲁肽通过激活Notch信号通路促进MC3T3-E1细胞增殖分化并抑制血清饥饿诱导的细胞凋亡。2.利拉鲁肽通过Notch信号通路与β-catenin交联激活Wnt信号通路促进MC3T3-E1细胞增殖分化并抑制血清饥饿诱导的细胞凋亡。3.利拉鲁肽通过Notch信号通路与Gli1交联激活Hh信号通路促进MC3T3-E1细胞增殖分化并抑制血清饥饿诱导的细胞凋亡。