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研究背景和目的:肌腱病(Tendinopathy)是骨科常见疾病,常见的肌腱病有跟腱炎、网球肘、冈上肌腱炎等三十余种,职业运动员发生肌腱病往往意味着运动生涯的终结,目前对肌腱病尚无有效的治疗方法。肌腱组织中出现异位骨化和脂肪组织是肌腱病的主要病理表现[1],多数学者认为过度使用导致的肌腱损伤是肌腱病的主要致病原因,但其致病机制不详。2007年Bi等[2]在肌腱组织中分离出了干细胞,称为肌腱干细胞(Tendon stem cells,TSCs),TSCs是肌腱细胞的前体细胞,具有多向分化潜能。Gulotta等[3]证实TSCs具有间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)相似的生物学特性,TSCs对于肌腱细胞再生及肌腱损伤的修复起重要作用。体外研究发现,TSCs细胞形态的改变可以影响其分化方向,对TSCs施加4%强度的机械牵伸应力,TSCs主要分化为肌腱细胞,参与肌腱细胞更新及肌腱组织修复,在8%强度的机械牵伸下,TSCs主要分化为非肌腱细胞(骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞)[4],然而机械牵伸引起TSCs发生成骨分化的分子生物学机制尚不清楚。研究机械牵伸条件下TSCs向骨细胞分化的分子生物学机制,对于揭示肌腱病的发病机制具有重要意义。Wnt信号通路在胚胎发育过程中起重要作用,Wnt信号通路分为经典及非经典信号通路,非经典的Wnt信号通路主要调控细胞极性、细胞粘附性及细胞运动,Wnt信号通路与骨细胞的形成、增殖及凋亡密切相关[5-6]。Wnt5a及Wnt5b属于非经典的Wnt信号通路,对细胞外应力敏感,并与干细胞成骨分化相关[7-8]。c-jun氨基末端激酶(c-Jun amino N-terminal protein kinases,JNK)于1990年被发现,是有丝分裂原激活的蛋白激酶家族(mitogen activated protein kinase,MAPK)的主要成员之一,JNK信号通路可被机械应力、细胞因子等因素激活,参与细胞凋亡、细胞分化、细胞骨架构建等生物学过程[9],JNK具有机械敏感性,并且可上调成骨基因Runx2[10],研究发现JNK信号通路可调控小鼠MC3T3-E1细胞的成骨分化[11]。非经典Wnt/PCP(planar cell polarity)信号通路调控JNK信号通路,位于JNK信号通路上游,在脊椎动物,Wnt5a、Wnt5b、Wnt11等作为配体,与卷发(frizzled)受体及其共同受体ror2结合,激活g蛋白及dvl,然后组装为dvl-rac1复合体,dvl-rac1复合体激活jnk激酶调节细胞骨架及细胞粘附性[12-15]。非经典wnt信号通路受其上游rho/rock分子调控,已证实rhoa/wnt5a调控机械牵伸应力诱导的干细胞成骨分化[8],而非经典wnt信号通路如何调控其下游分子以促进干细胞成骨分化尚有待于研究,机械应力诱导的干细胞成骨分化是否由wnt/jnk信号通路调控尚有待于研究。我们研究大鼠肌腱来源干细胞(rattendon-derivedstemcells,rtdscs)在机械牵伸应力诱导下的成骨分化能力;检测在机械牵伸应力诱导下非经典wnt信号通路中的wnt5a、wnt5b基因及蛋白水平的表达;磷酸化jnk(phosphorylatedjnk,p-jnk)水平;以及wnt5a,wnt5b与jnk间的相互调控关系;研究机械牵伸应力是否通过wnt5a/wnt5b/jnk信号通路调控rtdscs的成骨分化,探究肌腱组织异位骨化的形成机制。研究方法:第一部分:rtdscs干细胞特性及多向分化能力的鉴定。自大鼠跟腱组织中分离、培养细胞,用流式细胞术(flowcytometry,fcm)测定细胞的表面标记物:cd31抗体、cd44抗体、cd90抗体、cd34抗体,用免疫荧光法检测核干细胞因子抗体(nucleostemin)、nanog抗体、八聚体结合转录因子4抗体(octamer-bindingtranscriptionfactor4,oct-4)。加入干细胞成骨诱导培养基做成骨诱导实验,加入普通生长基(growthmedium,gm)作为对照,成骨诱导21天后提取rna,用实时定量聚合酶链式反应(real-timepolymerasechainreaction,rt-pcr)检测成骨基因runx2、dix5mrna表达,并做茜素红染色实验;用干细胞成脂诱导培养基做成脂诱导实验,而加入gm作为对照组,成脂诱导14天后提取rna,rt-pcr检测成脂基因pparγ、ap2mrna表达,并做油红染色实验;用干细胞成软骨诱导培养基做成软骨诱导实验,在诱导21天后将形成的软骨团块切片做阿尔新蓝染色。第二部分:检测rtdscs经单轴机械牵伸(uniaxialmechanicaltension,umt)诱导后的成骨分化能力。rtdscs在牵伸频率为1hz、牵伸强度为8%的条件下经umt诱导48、60、72h,用rt-pcr检测成骨基因runx2,dlx5,alpl,col1a1mrna相对于非牵伸对照组(non-loadingcontrol,nc)的表达,用免疫印迹法(westernblot,wb)测定runx2蛋白相对于nc的表达,并做碱性磷酸酶染色实验。第三部分:rtdscs经umt诱导48、60、72h后检测wnt5a、wnt5b、ror2、rac1mrna相对于nc的表达。在umt诱导48、60h后wb检测wnt5a、wnt5b蛋白相对于nc的表达。第四部分:研究wnt5a及wnt5b是否调控umt诱导的runx2蛋白表达。用短发夹rna(shorthairpinrna,shrna)慢病毒分别干扰rtdscs的wnt5a及wnt5b基因,然后rtdscs经umt诱导60h,wb检测runx2蛋白相对于慢病毒对照组的表达。第五部分:分别用4%、8%强度的umt诱导rtdscs24h,用罗丹明-鬼笔环肽染色法检测rtdscs的细胞骨架改变。rtdscs经umt诱导48、60h后检测p-jnk水平。umt诱导前30min,在rtdscs培养基中分别加入jnk兴奋剂茴香霉素(anisomycin,am)、jnk抑制剂sp600125,umt诱导60h后wb检测runx2蛋白相对于未加药物干预组的表达。分别用互补脱氧核糖核酸(cdna)过表达rtdscs的jnk基因、shrna干扰rtdscs的jnk基因,然后施加umt诱导,进一步证实jnk对umt诱导的rtdscs成骨分化具有调控作用。第六部分:分别用shrna干扰rtdscs的wnt5a、wnt5b基因,施加umt诱导后同时检测p-jnk水平和runx2蛋白表达,研究wnt5a、wnt5b是否对jnk有调控作用;证实umt通过wnt5a/wnt5b/jnk信号通路促进rtdscs的成骨分化。研究结果:第一部分:在大鼠跟腱组织中分离、培养细胞,流式细胞分析表明细胞表面标记物cd90抗体阳性,免疫荧光检测表明核干细胞因子抗体、nanog抗体、oct-4抗体阳性。加入成骨诱导培养基组的成骨基因runx2、dix5mrna表达较gm组明显升高,成骨诱导后茜素红染色阳性;加入成脂诱导培养基组的成脂基因pparγ、ap2mrna表达较gm组明显升高,油红染色阳性;细胞经成软骨诱导21天后形成软骨团块,阿尔新蓝染色阳性。第二部分:rtdscs经umt诱导48、60、72h后成骨基因runx2,dlx5,alpl,col1a1mrna表达较nc组高,runx2蛋白水平也较nc组高。rtdscs经umt诱导72h后alp染色阳性。第三部分:rtdscs经umt诱导48、60、72h后wnt5a、wnt5b、ror2、rac1mrna表达相对于nc升高,wb检测wnt5a、wnt5b在umt诱导48、60h的蛋白表达相对于nc组升高。第四部分:用shrna干扰wnt5a、wnt5b基因,经umt诱导60h后提取蛋白做wb检测,结果runx2蛋白表达较慢病毒对照组下降。第五部分:罗丹明-鬼笔环肽染色显示,rtdscs经umt诱导后细胞骨架发生不可逆改变,umt可上调p-jnk水平(相对于nc组),jnk兴奋剂am及抑制剂SP600125分别促进及抑制UMT诱导的Runx2 mRNA及蛋白表达。用cDNA及shRNA干扰JNK基因,分别促进及抑制UMT诱导的Runx2表达。第六部分:shRNA干扰rTDSCs的Wnt5a、Wnt5b基因可抑制UMT诱导的Runx2蛋白及P-JNK表达,Wnt5a、Wnt5b shRNA对UMT诱导的Runx2抑制作用可通过JNK兴奋剂AM解救。结论:第一部分:从大鼠跟腱分离、培养的细胞采用FCM及免疫荧光检测具有干细胞的特性,并且这种细胞具有向骨细胞、脂肪细胞软骨细胞分化的能力。第二部分:rTDSCs经UMT诱导后Runx2的mRNA及蛋白水平均较NC组升高,ALP染色阳性,UMT可以诱导rTDSCs成骨分化。第三部分:rTDSCs经UMT后Wnt5a、Wnt5b高表达,表现为Wnt5a、Wnt5b的mRNA及蛋白表达较NC组升高。第四部分:非经典Wnt信号通路中的Wnt5a、Wnt5b对UMT诱导的rTDSCs成骨分化具有调控作用。第五部分:UMT诱导后,rTDSCs的细胞骨架发生不可逆改变,并且JNK磷酸化水平较NC组升高,JNK对UMT诱导的rTDSCs成骨分化也具有调控作用。第六部分:rTDSCs在UMT诱导条件下,Wnt5a、Wnt5b对JNK有调控作用,rTDSCs在UMT诱导下的成骨分化可通过Wnt5a、Wnt5b/JNK信号通路调控。