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第一部分建立VPA孤独症大鼠模型目的对孕鼠腹腔注入丙戊酸钠(VPA),建立孤独症模型大鼠。方法:1.将育龄SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠和雌性大鼠同笼后,在雌性SD大鼠孕12.5d时腹腔注射VPA600mg/kg(浓度250mg/ml)或等量生理盐水。两组子代大鼠分别进行三箱社交实验、旷场实验和自我捋毛实验等行为学观察,判断是否成功建立VPA孤独症雄性大鼠模型。2.分组:SD母鼠孕12.5d腹腔注射生理盐水和VPA的雄性子代分别分入对照组(Control)孤独症模型组(VPA组)。3.检测指标:3.1三箱社交实验(three chamber sociability test)检测两组大鼠社交行为。3.2旷场实验(Open-field test)检测两组大鼠的自发性探索运动活性和情绪。3.3自我捋毛实验(self-grooming test)检测两组大鼠刻板重复行为行为。结果:1.三箱实验显示:VPA组大鼠在陌生鼠笼盒中停留的时间以及与陌生鼠嗅触交流的时间明显短于Control组(p<0.05)。而在空笼盒和中间笼盒停留时间明显长于Control组(p<0.05)。提示:VPA模型大鼠的社会交流行为显著减少。2.旷场实验提示,相较于Control组,VPA组大鼠垂直分数和中央运动次数有显著降低(p<0.05)。3.自我捋毛实验提示,相较于Control组,VPA组大鼠10min内自我捋毛时间有显著增加(p<0.01)。结论SD母鼠孕12.5d腹腔注射丙戊酸钠能够导致其雄性子代出现孤独症特征性症状,成功复制稳定的孤独症动物模型。第二部分观察VPA孤独症大鼠的生长发育规律目的观察VPA孤独症大鼠早期生理发育以及神经系统发育的特点。方法1.分组:对照组(Control)和孤独症模型组(建模成功的VPA大鼠)。2.检测指标:2.1生理发育规律的检测指标:两组大鼠身长、体重、尾长的变化情况;睁眼、牙齿萌出、腹部毛发长出、全身绒毛长出、全身白毛长出、耳廓分离、张耳及睾丸下降出现的时间。2.2中枢神经系统发育的检测指标:2.2.1神经反射功能指标:两组大鼠转体、平面翻正、负趋地性、断崖回避以及空中翻正现象的出现时间。2.2.2运动协调能力和肌张力情况指标:两组大鼠爬行和抓杆现象的出现时间、抓杆持续时间、游泳评分以及足展开距离。2.2.3感觉功能指标:两组大鼠听觉反射、视觉定位和夹尾反射现象的出现时间以及归巢所需时间。2.3孤独症样行为的检测指标:通过三箱社交实验、旷场实验、自我捋毛实验以及水迷宫实验,以检测两组大鼠社交行为、刻板行为、自发性探索运动活性、焦虑行为及学习记忆能力。结果1.通过对早期生理发育情况的检测,提示:相较于Control组,VPA组大鼠身长、体重在生长发育过程中有一定波动,但在PN28d未见明显差异(p>0.05);VPA组大鼠睁眼、牙齿萌出、腹部毛发长出、全身绒毛长出、全身白毛长出、耳廓分离、张耳以及睾丸下降结果均未见统计学差异(p>0.05);但尾长明显缩短(p<0.01),出现弯曲畸形。2.通过对神经系统发育情况的检测提示:2.1神经反射功能指标:相较于Control组,VPA组大鼠神经反射功能指标中平面翻正、负趋地性、断崖回避及空中翻正的阳性天数均明显延迟(p<0.05),转体的阳性天数测试结果无明显差异(p>0.05),神经反射发育滞后。2.2运动协调能力和肌张力情况指标:相较于Control组,爬行的阳性天数较晚(p<0.01),VPA组大鼠抓杆持续时间明显缩短(p<0.01),PN8d和PN10d游泳评分显著下降(p<0.05),PN15d和PN30d足展开距离增宽(p<0.01),抓杆的阳性天数无明显改变(p>0.05),运动协调能力降低以及前后肢肌张力下降。2.3感觉功能指标:相较于Control组,VPA组大鼠听觉反射的阳性天数明显提前(p<0.05),视觉定位的阳性天数显著滞后(p<0.01),而夹尾反射的阳性天数和归巢所耗时间无明显改变(p>0.05),听觉更为灵敏而视觉较迟滞,嗅觉和痛觉无明显变化。3.通过对两组大鼠社交行为、刻板行为、情绪改变及学习记忆能力情况检测提示:3.1三箱社交实验:相较于Control组,VPA组大鼠停留在陌生鼠1笼盒的时间以及与陌生鼠1的嗅触时间均明显减少(p<0.05),在中间笼盒和空笼盒停留时间明显增多(p<0.05),社交行为显著减少;当空笼子内放入陌生鼠2后,VPA组大鼠停留在陌生鼠2笼盒的时间以及与陌生鼠2的嗅触时间均明显减少(p<0.05),在中间笼盒和熟悉鼠(陌生鼠1)笼盒停留的时间明显增多(p<0.05),新鲜事物偏好障碍。3.2旷场实验:VPA组大鼠垂直运动分数及中央运动均明显减少(p<0.05),陌生环境内自发性探索行为减少,认知能力和适应性减弱;VPA组大鼠便溺次数无明显改变,无明显焦虑情绪改变。3.3自我捋毛实验:VPA组大鼠自我捋毛时间显著增长(p<0.01),刻板行为明显增加。3.4 Morris水迷宫实验:VPA组大鼠隐蔽平台实验中到达目标象限平台潜伏期明显增长(p<0.05),游泳速度减慢(p<0.05);空间探索实验中穿越目标象限次数以及目标象限停留时间比明显减低(p<0.05),游泳速度减慢(p<0.05),空间学习记忆能力下降。结论VPA孤独症大鼠的神经系统发育滞后并出现明显的孤独症行为;但机体生理发育与对照大鼠间无明显差异。第三部分VPA孤独症大鼠不同脑区内GABA能神经元的表达目的探讨VPA孤独症大鼠神经系统发育滞后及孤独症样症状与发育中不同阶段,不同脑区的GABA能神经元异常表达是否相关。方法1.分组:对照组(Control)和孤独症模型组(建模成功的VPA大鼠)。2.检测指标:2.1 Western Blot检测实验大鼠出生后第7d、14d、28d、35d、45d以及72d时,大脑前额叶皮层、颞叶皮层、体感皮层、海马以及小脑皮层内GAD67蛋白水平的表达。2.2免疫组化结合图像分析检测实验大鼠出生后7d、35d以及72d时,大脑前额叶皮层、颞叶皮层、体感皮层、海马以及小脑皮层中GAD67免疫阳性神经元的表达情况。结果1.Western Blot检测提示,相较于Control组,VPA组大鼠出生后第7d、14d、28d、35d、45d以及72d时,其大脑海马及小脑皮层中GAD67蛋白水平均明显减少(p<0.05);前额叶皮层中GAD67蛋白水平在发育早期无变化(p>0.05),45d及72d时蛋白表达增加(p<0.05);颞叶皮层中GAD67蛋白水平在发育早期无明显变化,72d时GAD67蛋白表达明显减少(p<0.05)体感皮层中GAD67蛋白水平在整个发育过程中均无明显变化(p>0.05)。2.免疫组化及图像分析检测提示,相较于Control组,VPA组大鼠出生后7d和35d时,其大脑前额叶皮层、颞叶皮层以及体感皮层中GAD67免疫阳性神经元表达没有明显改变(p>0.05),但海马及小脑皮质中GAD67免疫阳性神经元的表达均明显减少(p<0.05);VPA组大鼠出生后第72d时,其大脑前额叶皮层中GAD67免疫阳性神经元增多(p<0.05),而颞叶皮层、海马以及小脑皮层中GAD67免疫阳性神经元显著减少(p<0.05),体感皮层中GAD67免疫阳性神经元无明显改变(p>0.05)。结论神经系统发育过程中,GABA能神经元表达改变所导致的大脑兴奋-抑制失衡可能是孤独症发病的重要因素之一。